【概(gai)要(yao)描(miao)述(shu)】40%單/雙(shuang)丙烯(xi)酰(xian)胺預制膠(jiao)溶液(ye)（29:）
Western Blot)是(shi)將(jiang)蛋(dan)白質(zhi)轉移到(dao)膜(mo)上，然(ran)後利用(yong)抗體進(jin)行(xing)檢測。

壹、 原(yuan)理(li)

與(yu)Southern或Northern雜交方法類似，但(dan)Western Blot采用(yong)的是(shi)聚丙烯(xi)酰(xian)胺凝膠電泳，被(bei)檢測物(wu)是(shi)蛋(dan)白質(zhi)，“探(tan)針(zhen)”是抗(kang)體，“顯色(se)”用(yong)標(biao)記(ji)的(de)二(er)抗。經過(guo)PAGE分離(li)的蛋(dan)白質(zhi)樣品(pin)，轉(zhuan)移到(dao)固(gu)相(xiang)載體（例如硝#纖維素(su)薄(bo)膜）上，固(gu)相(xiang)載體以(yi)非(fei)共價鍵形式吸附蛋(dan)白質(zhi)，且能保持(chi)電泳分離的(de)多(duo)肽類型及(ji)其(qi)生物(wu)學活(huo)性(xing)不(bu)變。以(yi)固相(xiang)載體上的(de)蛋(dan)白質(zhi)或多(duo)肽作(zuo)為(wei)抗原，與(yu)對(dui)應的抗體起免疫(yi)反應，再與(yu)酶或同(tong)位(wei)素標(biao)記(ji)的(de)第(di)二抗體起反(fan)應，經過(guo)底物(wu)顯色(se)或放(fang)射自顯影(ying)以(yi)檢測電泳分離的(de)特(te)異(yi)性(xing)目(mu)的(de)基因表達的蛋(dan)白成(cheng)分。該技術也廣泛應用(yong)於檢測蛋(dan)白水(shui)平的表(biao)達。

二、分(fen)類40%單/雙(shuang)丙烯(xi)酰(xian)胺預制膠(jiao)溶液(ye)（29:）
現(xian)常(chang)用(yong)的有底物(wu)化學發(fa)光ECL和底(di)物(wu)DAB呈色(se)，體同(tong)水(shui)平和實(shi)驗(yan)條(tiao)件(jian)的是用(yong)*種(zhong)方法(fa)，目前(qian)發(fa)表文章(zhang)通(tong)常(chang)是(shi)用(yong)底物(wu)化學發(fa)光ECL。只要(yao)買(mai)現(xian)成(cheng)的試劑(ji)盒(he)就(jiu)行(xing)，操(cao)作(zuo)也比較簡(jian)單(dan)，原(yuan)理(li)如下（二抗(kang)用(yong)HRP標(biao)記(ji)）：反應底物(wu)為(wei)過(guo)氧化物(wu)+魯(lu)米諾，如遇(yu)到(dao)HRP，即(ji)發(fa)光，可使膠(jiao)片(pian)曝光，就可洗(xi)出條(tiao)帶(dai)。

三、 主(zhu)要(yao)試(shi)劑

、 丙烯(xi)酰(xian)胺和(he)N，N’-亞(ya)甲雙(shuang)丙烯(xi)酰(xian)胺，應以(yi)溫(wen)熱（以(yi)利於溶解(jie)雙丙稀(xi)酰(xian)胺）的去離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制(zhi)含有29%（w/v）丙稀(xi)酰(xian)胺和(he)%（w/v）N，N’-亞(ya)甲雙(shuang)丙烯(xi)酰(xian)胺儲存液(ye)丙稀(xi)酰(xian)胺29g，N，N-亞(ya)甲叉(cha)雙丙稀(xi)酰(xian)胺g，加H2O至 00ml。）儲於棕色瓶(ping)，4℃避光保存。嚴格(ge)核實(shi)PH不得(de)超過(guo)7.0，因可(ke)以(yi)發(fa)生脫(tuo)氨基反(fan)應是光催化或堿催化的(de)。使(shi)用(yong)期不(bu)得超(chao)過(guo)兩個(ge)月，隔幾(ji)個(ge)月須(xu)重新配(pei)制。如有沈澱(dian)，可以(yi)過(guo)濾。 2、 十(shi)二烷(wan)基(ji)硫#鈉SDS溶液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制(zhi)，室(shi)溫(wen)保存(cun)。

3、 分離(li)膠緩(huan)沖(chong)液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合，加水稀(xi)釋到(dao)00ml終體積(ji)。過(guo)濾後(hou)40℃保存(cun)。

4、 濃(nong)縮膠(jiao)緩(huan)沖(chong)液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於40mlH2O中，用(yong)約48ml mol/L HCl調(tiao)至(zhi)pH6.8加水稀(xi)釋到(dao)00ml終體積(ji)。過(guo)濾後(hou)40C保存(cun)。這(zhe)兩種(zhong)緩(huan)沖(chong)液(ye)必(bi)須(xu)使用(yong)Tris堿制備(bei)，再用(yong)HCL調(tiao)節PH值，而(er)不用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原溶(rong)液(ye)N，N，N’N’四甲(jia)基乙(yi)二(er)胺(an)催化過(guo)硫#銨形成自由基(ji)而加速兩種(zhong)丙稀(xi)酰(xian)胺的(de)聚合。PH太低(di)時，聚(ju)合反(fan)應受到(dao)抑(yi)制(zhi)。0%（w/v）過(guo)硫#胺溶(rong)液(ye)。提(ti)供兩種(zhong)丙稀(xi)酰(xian)胺聚(ju)合所(suo)必須(xu)的自由基(ji)。去離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制(zhi)數(shu)ml，臨(lin)用(yong)前配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加樣緩(huan)沖(chong)液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖(chong)液(ye)8ml，甘油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙醇(chun)3.2ml，0.05%溴酚(fen)藍.6ml，H2O 32ml混勻(yun)備(bei)用(yong)。按:或:2比例與(yu)蛋(dan)白質(zhi)樣品(pin)混(hun)合，在沸(fei)水(shui)終煮3min混勻(yun)後再(zai)上(shang)樣(yang)，壹般(ban)為(wei)20-25ul，總(zong)蛋(dan)白量00μg。

7、 Tris-甘氨#電泳緩(huan)沖(chong)液(ye):30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用(yong)蒸餾(liu)水(shui)溶(rong)解(jie)至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極(ji)緩(huan)沖(chong)液(ye)。臨(lin)用(yong)前稀(xi)釋0倍(bei)。

8、 轉移緩(huan)沖(chong)液(ye)：配(pei)制(zhi)L轉移緩(huan)沖(chong)液(ye)，需稱(cheng)取(qu)2.9g甘氨#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並(bing)加入200ml甲醇(chun)，加水至總(zong)量L。

9、 麗春(chun)紅(hong)染(ran)液(ye)儲存液(ye)：麗(li)春(chun)紅(hong)S 2g 三#乙#30g 磺基(ji)水(shui)楊# 30g 加水至00ml 用(yong)時上(shang)述(shu)儲存液(ye)稀(xi)釋0倍(bei)即(ji)成麗(li)春(chun)紅(hong)S使用(yong)液(ye)。使(shi)用(yong)後應予(yu)以(yi)廢(fei)棄。

0、 脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮(dan)鈉（有毒(du)，戴(dai)手套(tao)操(cao)作(zuo)），溶於磷#緩(huan)沖(chong)鹽(yan)溶液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖(chong)鹽(yan)溶液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗(kang)人(ren)-MMP-9（6）鼠抗(kang)人(ren)-TIMP-。

4、 過(guo)氧化物(wu)酶標(biao)記(ji)的(de)第(di)二抗體。

5、 NBT（溶於70%二甲(jia)基甲(jia)酰(xian)胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於00%二甲(jia)基甲(jia)酰(xian)胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA窄譜(pu) 預染蛋(dan)白質(zhi)分子(zi)量標(biao)準(zhun)（藍色(se)，2-7lkDa）做(zuo)線(xian)粒體膜UCP2蛋(dan)白的(de)Western Blot （以(yi)下簡(jian)寫(xie)成(cheng)Western Blot），提(ti)取(qu)線粒體後凍(dong)存(cun)（未加蛋(dan)白酶抑(yi)制(zhi)劑），樣品不(bu)能(neng)反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong);，加蛋(dan)白酶抑(yi)制(zhi)劑。同(tong)時(shi)，建議(yi)檢查Western Blot過(guo)程， 提(ti)高(gao)壹抗(kang)濃(nong)度。對(dui)於加蛋(dan)白酶抑(yi)制(zhi)劑來說(shuo)，壹般(ban)加PMSF就可以(yi)了，能多加幾(ji)中種(zhong)蛋(dan)白酶抑(yi)制(zhi)劑。
同(tong)壹蛋(dan)白樣(yang)品能(neng)同(tong)時(shi)進(jin)行(xing)兩種(zhong)因子(zi)的(de)Western Blot檢測，有的甚至可(ke)以(yi)同(tong)時(shi)測(ce)幾(ji)十(shi)種(zhong)樣品(pin)。
如果是膜蛋(dan)白和(he)胞漿(jiang)蛋(dan)白，所(suo)用(yong)的去垢(gou)劑(ji)就要(yao)溫(wen)和得(de)多，這(zhe)時加上NaF去抑(yi)制(zhi)磷#化酶的活(huo)性(xing)。
樣(yang)品的蛋(dan)白含量很(hen)低(di)，每(mei)微升(sheng)不到(dao)微(wei)克(ke)，但是(shi)在轉膜(mo)時經(jing)常(chang)會(hui)發(fa)現(xian)只有壹部分(fen)蛋(dan)白轉(zhuan)到(dao)了膜上，就(jiu)是在轉膜(mo)後染(ran)膠(jiao)發(fa)現(xian)有的孔(kong)所(suo)有的蛋(dan)白條(tiao)帶(dai)都在，只是顏色變淡了，可以(yi)加大(da)上樣(yang)量，轉(zhuan)移時可(ke)以(yi)用(yong)減(jian)少(shao)電流延長(chang)時(shi)間(jian)，多(duo)加5-0%甲醇。
想(xiang)分離(li)的(de)蛋(dan)白是(shi)分子(zi)量260kd的(de)，SDS-PAGE電泳的分離(li)膠(jiao)濃(nong)度用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的(de)蛋(dan)白不(bu)好(hao)做(zuo)
如果上樣量超(chao)載，可以(yi)濃(nong)縮樣(yang)品，也可(ke)以(yi)根(gen)據(ju)妳的目標(biao)分(fen)子(zi)量透析(xi)掉(diao)壹部分(fen)小分(fen)子(zi)蛋(dan)白。壹般(ban)地，超(chao)載30%是不(bu)會(hui)有問題(ti)的。如果已經(jing)超(chao)了不少了，而且小分(fen)子(zi)量的(de)也要(yao)，可(ke)以(yi)考(kao)慮(lv)加大(da)膠的(de)厚(hou)度，可(ke)以(yi)試試.5mm的(de) comb。
蛋(dan)白變性後存放(fang)-80℃，壹兩(liang)年沒有問題(ti)，zui關鍵兩條(tiao)：不(bu)要(yao)被(bei)蛋(dan)白酶水解(jie)掉;不(bu)要(yao)被(bei)細(xi)菌消(xiao)化掉(diao)（也是(shi)被(bei)酶水解(jie)了）。
采用(yong)DAB顯色(se)技(ji)術，二(er)抗是化的(de)多(duo)克(ke)隆抗(kang)體，三抗是親和(he)素體系，不能使用(yong)脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉(fen)，脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉(fen)會(hui)影響(xiang)親和(he)素的(de)生成，因為脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉(fen)中含，用(yong)BSA代(dai)替應該好(hao)壹點.
Western Blot壹般(ban)上(shang)樣30-00微克(ke)不等(deng)，結(jie)果跟目的蛋(dan)白的(de)豐(feng)度、上(shang)樣(yang)量、壹二(er)抗(kang)的量和(he)撫(fu)育時間(jian)都有關系，也與(yu)顯色(se)時(shi)間長(chang)短(duan)有關。開(kai)始摸條(tiao)件(jian)時，為了拿到(dao)陽(yang)性(xing)結(jie)果，各(ge)個(ge)步(bu)驟(zhou)都可(ke)以(yi)量多(duo)壹點時間長(chang)壹點，當然(ran)背景也就(jiu)出(chu)來了。要(yao)拿(na)到(dao)好(hao)的結(jie)果，如果抗體好(hao)的話(hua)比較容易(yi)，抗體不好(hao)的話(hua)就需要(yao)反(fan)復(fu)地試(shi)了，當然(ran)有的不(bu)適(shi)合Western Blot的(de)怎樣做(zuo)也不(bu)行(xing)。所以(yi)拿到(dao)好(hao)的結(jie)果不容易(yi)。