【概要描(miao)述(shu)】40%單/雙(shuang)丙烯(xi)酰(xian)胺預制(zhi)膠溶(rong)液(ye)（9:） Western Blot)是將(jiang)蛋(dan)白(bai)質轉(zhuan)移(yi)到(dao)膜上(shang)，然(ran)後利(li)用(yong)抗(kang)體進行(xing)檢測(ce)。

40%單/雙(shuang)丙烯(xi)酰(xian)胺預制(zhi)膠溶(rong)液(ye)（9:）   Western Blot技術(shu):

壹、 原理(li)

與(yu)Southern或Northern雜交方(fang)法(fa)類似(si)，但Western Blot采用的是聚(ju)丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺凝膠電泳，被檢測(ce)物(wu)是蛋(dan)白(bai)質，“探針(zhen)”是抗(kang)體，“顯(xian)色”用標記的(de)二(er)抗(kang)。經過(guo)PAGE分離(li)的(de)蛋(dan)白(bai)質樣品(pin)，轉(zhuan)移(yi)到(dao)固相(xiang)載(zai)體（例(li)如(ru)硝(xiao)#纖維素薄膜）上(shang)，固相(xiang)載(zai)體以非共價(jia)鍵(jian)形(xing)式吸(xi)附蛋(dan)白(bai)質，且(qie)能保(bao)持電泳分離(li)的(de)多(duo)肽類型(xing)及其生(sheng)物(wu)學活(huo)性不變(bian)。以(yi)固相(xiang)載(zai)體上(shang)的(de)蛋(dan)白(bai)質或多(duo)肽作為抗(kang)原，與(yu)對(dui)應(ying)的抗(kang)體起免疫(yi)反(fan)應(ying)，再與(yu)酶(mei)或(huo)同位素標記的第(di)二抗(kang)體起反(fan)應(ying)，經過(guo)底物(wu)顯(xian)色或(huo)放射(she)自顯(xian)影以(yi)檢測(ce)電泳分離(li)的(de)特異(yi)性目的(de)基因(yin)表達的(de)蛋白(bai)成(cheng)分。該(gai)技術(shu)也(ye)廣泛應(ying)用於檢測(ce)蛋(dan)白(bai)水平的(de)表達。

二(er)、分類40%單(dan)/雙(shuang)丙烯(xi)酰(xian)胺預制(zhi)膠溶(rong)液(ye)（9:）  現常(chang)用(yong)的(de)有底物(wu)化學發光ECL和底物(wu)DAB呈(cheng)色(se)，體同水平和(he)實(shi)驗條(tiao)件(jian)的是(shi)用*種方(fang)法(fa)，目前(qian)發(fa)表文章(zhang)通(tong)常是用底物(wu)化學發光ECL。只要買現(xian)成(cheng)的(de)試(shi)劑(ji)盒就行(xing)，操(cao)作也比(bi)較簡(jian)單(dan)，原理(li)如(ru)下（二抗(kang)用HRP標記）：反(fan)應(ying)底物(wu)為過氧(yang)化物+魯(lu)米(mi)諾(nuo)，如(ru)遇到HRP，即發光，可使膠片(pian)曝光，就可洗出條(tiao)帶。

三(san)、 主要試(shi)劑(ji)

、 丙烯(xi)酰(xian)胺和N，N’-亞甲雙(shuang)丙烯(xi)酰(xian)胺，應(ying)以溫(wen)熱(re)（以利(li)於溶(rong)解雙(shuang)丙稀(xi)酰(xian)胺）的去離(li)子(zi)水配制(zhi)含(han)有29%（w/v）丙稀(xi)酰(xian)胺和%（w/v）N，N’-亞甲雙(shuang)丙烯(xi)酰(xian)胺儲存液(ye)丙稀(xi)酰(xian)胺29g，N，N-亞甲叉雙(shuang)丙稀(xi)酰(xian)胺g，加H2O至(zhi) 00ml。）儲於棕色(se)瓶，4℃避光保存。嚴格(ge)核實PH不得超過(guo)7.0，因(yin)可以發(fa)生(sheng)脫氨基反(fan)應(ying)是光催化或堿催(cui)化的。使用期(qi)不(bu)得超過兩(liang)個(ge)月(yue)，隔幾個(ge)月須重新(xin)配制(zhi)。如(ru)有沈澱，可(ke)以(yi)過濾(lv)。  2、 十(shi)二(er)烷(wan)基硫(liu)#鈉SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離(li)子(zi)水配制(zhi)，室(shi)溫(wen)保存。

3、 分離(li)膠緩(huan)沖液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混(hun)合(he)，加水稀(xi)釋(shi)到00ml終(zhong)體積(ji)。過(guo)濾(lv)後40℃保存。

4、 濃縮膠緩(huan)沖液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於40mlH2O中，用約48ml mol/L HCl調(tiao)至(zhi)pH6.8加水稀(xi)釋(shi)到00ml終(zhong)體積(ji)。過(guo)濾(lv)後40C保存。這(zhe)兩種緩(huan)沖液(ye)必須使用Tris堿制(zhi)備(bei)，再用(yong)HCL調(tiao)節(jie)PH值，而不(bu)用 Tris.CL。

5、 TEMED原溶(rong)液(ye)N，N，N’N’四甲(jia)基乙(yi)二胺(an)催化過硫#銨形(xing)成自由(you)基而加(jia)速兩種丙稀(xi)酰(xian)胺的聚合(he)。PH太(tai)低時，聚合(he)反(fan)應(ying)受(shou)到抑(yi)制。0%（w/v）過硫#胺溶(rong)液(ye)。提(ti)供兩(liang)種丙稀(xi)酰(xian)胺聚合(he)所必須的自由(you)基。去離(li)子(zi)水配制(zhi)數(shu)ml，臨用前(qian)配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加樣緩(huan)沖液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖液(ye)8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚藍.6ml，H2O 32ml混(hun)勻備(bei)用。按:或:2比例(li)與(yu)蛋白(bai)質樣品(pin)混(hun)合(he)，在沸水終(zhong)煮(zhu)3min混(hun)勻後再上(shang)樣，壹般為20-25ul，總蛋白(bai)量00μg。

7、 Tris-甘氨#電泳緩(huan)沖液(ye):30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用蒸(zheng)餾(liu)水溶(rong)解至(zhi)000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極緩(huan)沖液(ye)。臨用(yong)前(qian)稀(xi)釋(shi)0倍(bei)。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖液(ye)：配制(zhi)L轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖液(ye)，需稱(cheng)取(qu)2.9g甘氨#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並(bing)加(jia)入200ml甲醇，加水至(zhi)總量L。

9、 麗(li)春(chun)紅(hong)染(ran)液(ye)儲存(cun)液(ye)：麗(li)春(chun)紅(hong)S 2g 三(san)#乙#30g 磺基水楊(yang)# 30g 加水至(zhi)00ml 用時上(shang)述(shu)儲存(cun)液(ye)稀(xi)釋(shi)0倍(bei)即(ji)成(cheng)麗(li)春(chun)紅(hong)S使用液(ye)。使用(yong)後應(ying)予(yu)以廢棄(qi)。

0、 脫脂(zhi)奶(nai)粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉（有毒(du)，戴(dai)手套(tao)操作），溶(rong)於磷#緩(huan)沖鹽溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖鹽溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗(kang)人-MMP-9（6）鼠(shu)抗(kang)人-TIMP-。

4、 過氧(yang)化物酶(mei)標(biao)記(ji)的(de)第(di)二抗(kang)體。

5、 NBT（溶(rong)於70%二甲基甲(jia)酰(xian)胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於00%二甲基甲(jia)酰(xian)胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L   做線粒體膜UCP2蛋白(bai)的(de)Western Blot （以下(xia)簡寫(xie)成(cheng)Western Blot），提(ti)取(qu)線(xian)粒(li)體後凍(dong)存（未(wei)加蛋白(bai)酶(mei)抑(yi)制劑(ji)），樣品(pin)不(bu)能反(fan)復(fu)凍(dong)融;，加蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)制劑(ji)。同時，建議檢查(zha)Western Blot過(guo)程(cheng)， 提(ti)高(gao)壹抗(kang)濃度。對(dui)於加蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)制劑(ji)來說，壹般加(jia)PMSF就(jiu)可(ke)以了，能多(duo)加幾(ji)中種蛋白(bai)酶(mei)抑(yi)制劑(ji)。
同壹蛋白(bai)樣品(pin)能同時進(jin)行(xing)兩(liang)種因(yin)子(zi)的Western Blot檢測(ce)，有(you)的甚(shen)至(zhi)可以(yi)同時測(ce)幾(ji)十(shi)種樣品(pin)。
如(ru)果是膜蛋白(bai)和(he)胞漿(jiang)蛋白(bai)，所用的(de)去垢(gou)劑(ji)就要溫(wen)和得多(duo)，這(zhe)時加(jia)上(shang)NaF去抑(yi)制磷(lin)#化酶(mei)的(de)活(huo)性。
樣品(pin)的(de)蛋(dan)白(bai)含(han)量很低，每微(wei)升(sheng)不(bu)到(dao)微(wei)克(ke)，但是(shi)在轉(zhuan)膜時經(jing)常(chang)會(hui)發(fa)現(xian)只有(you)壹部(bu)分蛋(dan)白(bai)轉(zhuan)到(dao)了膜上(shang)，就(jiu)是(shi)在轉(zhuan)膜後染(ran)膠發(fa)現(xian)有的(de)孔(kong)所有的(de)蛋(dan)白(bai)條(tiao)帶都(dou)在，只(zhi)是(shi)顏色(se)變淡(dan)了，可(ke)以加大上(shang)樣量，轉(zhuan)移(yi)時(shi)可(ke)以(yi)用減少(shao)電流延長時(shi)間，多(duo)加5-0%甲(jia)醇。
想(xiang)分離(li)的(de)蛋(dan)白(bai)是(shi)分子(zi)量260kd的，SDS-PAGE電泳的分離(li)膠濃度用6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的(de)蛋(dan)白(bai)不(bu)好做(zuo)
如(ru)果上(shang)樣量超載(zai)，可(ke)以(yi)濃縮樣品(pin)，也(ye)可(ke)以(yi)根(gen)據(ju)妳(ni)的(de)目(mu)標(biao)分子(zi)量透析掉壹部(bu)分小(xiao)分子(zi)蛋白(bai)。壹般地(di)，超載(zai)30%是(shi)不(bu)會(hui)有(you)問題(ti)的(de)。如(ru)果已(yi)經超(chao)了不少(shao)了，而且(qie)小(xiao)分子(zi)量的也要，可(ke)以考慮(lv)加(jia)大膠的(de)厚度，可以(yi)試(shi)試(shi).5mm的(de) comb。
蛋白(bai)變(bian)性後存放-80℃，壹兩年沒有(you)問題(ti)，zui關(guan)鍵(jian)兩條(tiao)：不(bu)要被蛋白(bai)酶(mei)水解掉;不要被細菌消化掉（也是被酶(mei)水解了(le)）。
采用DAB顯(xian)色技(ji)術(shu)，二(er)抗(kang)是化的多(duo)克隆(long)抗(kang)體，三(san)抗(kang)是親(qin)和素體系，不能使(shi)用脫脂(zhi)奶(nai)粉(fen)，脫脂(zhi)奶(nai)粉(fen)會(hui)影響(xiang)親(qin)和素的生成，因(yin)為脫脂(zhi)奶(nai)粉(fen)中含(han)，用(yong)BSA代(dai)替應(ying)該(gai)好壹點.
Western Blot壹般上(shang)樣30-00微(wei)克(ke)不(bu)等(deng)，結果跟(gen)目的(de)蛋白(bai)的(de)豐度、上(shang)樣量、壹二抗(kang)的量和撫育時(shi)間都(dou)有關(guan)系，也與(yu)顯(xian)色時(shi)間長短(duan)有關(guan)。開始摸條(tiao)件(jian)時，為了拿(na)到陽(yang)性結果(guo)，各(ge)個(ge)步(bu)驟都(dou)可以(yi)量多(duo)壹點時(shi)間長壹點，當(dang)然(ran)背(bei)景(jing)也就(jiu)出來了。要拿(na)到好的(de)結果，如(ru)果抗(kang)體好的(de)話比較容易(yi)，抗(kang)體不好的(de)話就需要反(fan)復(fu)地(di)試(shi)了(le)，當(dang)然(ran)有(you)的(de)不適合(he)Western Blot的怎(zen)樣做也(ye)不行(xing)。所以拿(na)到好的(de)結果不容易(yi)。