【概要(yao)描述】兔肝內膽管上皮細胞的相關產(chan)品：95-D [PLA-801D]人(ren)高(gao)轉(zhuan)移(yi)肺(fei)癌(ai)細胞鴨原代腦(nao)微血(xue)管內皮細胞兔原代Ⅱ型(xing)肺泡上皮細胞兔原代輸(shu)尿管成纖維細胞兔原代乳(ru)腺(xian)導管上皮細胞大鼠原代髓(sui)核(he)細胞人(ren)原代子(zi)宮內膜異位癥間(jian)質細胞羊原代睪(gao)丸(wan)間(jian)質細胞大鼠原代腎(shen)上腺(xian)皮(pi)質(zhi)細胞豬原代B淋巴(ba)細胞

兔肝內膽管上皮細胞

包被(bei)條(tiao)件(jian) 鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養基(ji) 含FBS、生(sheng)長添(tian)加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液(ye)頻率(lv) 每(mei)2-3天換(huan)液(ye)壹(yi)次(ci)

生(sheng)長特性(xing) 貼壁

細胞形態 上皮(pi)細胞樣

傳(chuan)代(dai)特性(xing) 可傳(chuan)1-2代左右

消(xiao)化液(ye) 0.25%yi蛋(dan)白酶(mei)

培養條(tiao)件 氣相：空氣(qi)，95%；CO2，5%

兔肝內膽管上皮分(fen)離自(zi)肝臟(zang)組織(zhi)；肝臟(zang)是(shi)身(shen)體(ti)內以代謝功(gong)能為主(zhu)的(de)壹(yi)個器(qi)官(guan)，並(bing)在身體(ti)裏(li)面起(qi)著(zhe)去(qu)氧化、儲(chu)存肝糖、分(fen)泌性(xing)蛋(dan)白質(zhi)的(de)合(he)成等作用(yong)；肝臟(zang)也(ye)制(zhi)造消(xiao)化系(xi)統中(zhong)之膽(dan)汁(zhi)。肝臟(zang)是(shi)機(ji)體(ti)內臟(zang)裏(li)最大的器(qi)官(guan)，位於(yu)機體(ti)中(zhong)的腹(fu)部位置，在右側橫隔膜之下，位於(yu)膽囊之前(qian)端且於(yu)右邊腎(shen)臟(zang)的(de)前(qian)方(fang)，胃(wei)的上方。肝臟(zang)是(shi)機(ji)體(ti)消(xiao)化系(xi)統中(zhong)最大的消(xiao)化腺(xian)，為(wei)壹(yi)紅棕(zong)色(se)的V字(zi)形器(qi)官(guan)。肝臟(zang)是(shi)尿(niao)素(su)合(he)成的主(zhu)要(yao)器(qi)官(guan)，又(you)是(shi)新(xin)陳(chen)代(dai)謝(xie)的(de)重(zhong)要(yao)器(qi)官(guan)。肝臟(zang)在機體(ti)位置和形(xing)態結(jie)構(gou)：肝臟(zang)位於(yu)右上腹，隱藏(zang)在右側膈下和肋骨深(shen)面，大部分(fen)肝為肋弓所(suo)復蓋，僅在腹上(shang)區(qu)、右肋弓間(jian)露(lu)出並(bing)直(zhi)接接(jie)觸腹前(qian)壁，肝上面則(ze)與(yu)膈及腹(fu)前(qian)壁相接。通過(guo)控(kong)制(zhi)激(ji)素調(tiao)控(kong)的分(fen)泌和吸(xi)收，在保持、調(tiao)整和擴大膽小(xiao)管的結構中(zhong)發揮重(zhong)要(yao)作用(yong)，肝內膽管上皮細胞在先(xian)天性(xing)和獲得性(xing)免(mian)疫應答(da)方面起(qi)著(zhe)積(ji)極作用(yong)。肝內膽管上皮細胞約(yue)占肝細胞總數(shu)的(de)5%，其(qi)在肝內膽道(dao)系(xi)統內(nei)形成復雜(za)的網(wang)狀管形結構。肝內膽管上皮細胞具(ju)有復雜(za)的生(sheng)理(li)代謝(xie)功(gong)能，參與(yu)肝臟(zang)的(de)代(dai)謝(xie)、排泌(mi)、免(mian)疫等(deng)生(sheng)理(li)過程(cheng)，在肝臟(zang)疾(ji)病的(de)發(fa)生(sheng)發展過(guo)程中(zhong)起(qi)壹(yi)定的作用(yong)。研(yan)究(jiu)表明(ming)，常見的肝內膽管病變(bian)例如原發性(xing)硬化性(xing)膽管炎、膽管癌(ai)等疾(ji)病，都(dou)是(shi)以肝內膽管上皮細胞為病變(bian)靶位，進而引起(qi)肝內膽管上皮損傷(shang)。因(yin)此，了解正常肝內膽管上皮細胞的生(sheng)物學(xue)特征和病變(bian)肝內膽管上皮細胞的病理(li)特征對(dui)研(yan)究(jiu)肝內膽管病變(bian)的發病機(ji)制(zhi)、診斷和治(zhi)療具(ju)有重(zhong)要(yao)意義。
方法(fa)簡(jian)介(jie)：

公司(si)實驗(yan)室(shi)分(fen)離的(de)兔肝內膽管上皮采用(yong)膠(jiao)原酶灌(guan)註(zhu)消(xiao)化法(fa)後(hou)，再(zai)用(yong)膠(jiao)原酶-DNA酶聯合消(xiao)化，通過(guo)上(shang)皮(pi)細胞專(zhuan)用(yong)培(pei)養基(ji)培養篩選制(zhi)備(bei)而來(lai)，細胞總量(liang)約(yue)為5×10?cells/瓶(ping)。
質量(liang)檢(jian)測：

公司(si)實驗(yan)室(shi)分(fen)離的(de)兔肝內膽管上皮 經Cytokeratin-18免(mian)疫熒(ying)光(guang)鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原體(ti)、細菌、酵母(mu)和真(zhen)菌(jun)等(deng)。

壹(yi)、細胞培養

1取(qu)材(cai) 在無(wu)菌環(huan)境下從機(ji)體(ti)取(qu)出某(mou)種組織(zhi)細胞（視實驗(yan)目的(de)而定），經過壹(yi)定的處理(li)（如消(xiao)化分(fen)散細胞、分(fen)離等(deng)）後(hou)接(jie)入培(pei)養器(qi)血(xue)中(zhong)，這(zhe)壹(yi)過(guo)程(cheng)稱(cheng)為(wei)取(qu)材(cai)。如是(shi)細胞株(zhu)的(de)擴大培養則(ze)無(wu)取(qu)材(cai)這(zhe)壹(yi)過(guo)程(cheng)。機(ji)體(ti)取(qu)出的組織(zhi)細胞的培(pei)養稱(cheng)為原代培養。2培(pei)養 將(jiang)取(qu)得的(de)組織(zhi)細胞接入培(pei)養瓶(ping)或(huo)培(pei)養板(ban)中(zhong)的過(guo)程稱為培養。3凍(dong)存及復蘇(su)（可參閱(yue)後(hou)面有關章(zhang)節(jie)）為了保存細胞，特別是(shi)不易(yi)獲得的(de)突(tu)變(bian)型(xing)細胞或細胞株(zhu)，要(yao)將細胞凍存。凍(dong)存的(de)溫(wen)度壹(yi)般(ban)用(yong)液(ye)氮(dan)的(de)溫(wen)度－196℃，將(jiang)細胞收集至(zhi)凍存管中(zhong)加(jia)入含保護劑（壹(yi)般(ban)為(wei)二甲亞(ya)碸(feng)或甘油(you)）的培(pei)養基(ji)，以壹(yi)定的冷(leng)卻速度(du)凍(dong)存，最終(zhong)保存於(yu)液氮中(zhong)。在極低(di)的溫(wen)度下，細胞保存的(de)時間(jian)幾(ji)乎是無(wu)限的(de)。復蘇(su)壹(yi)般(ban)采用(yong)快(kuai)融(rong)方法(fa)，即從液(ye)氮(dan)中(zhong)取(qu)出凍存管後(hou)，立(li)即(ji)放(fang)入37℃水中(zhong)，使之在壹(yi)分(fen)鐘內(nei)迅(xun)速融(rong)解。然後(hou)將(jiang)細胞轉(zhuan)入培(pei)養器(qi)皿(min)中(zhong)進行(xing)培養。

二、原代細胞分(fen)離

凡是(shi)來(lai)源(yuan)於(yu)胚胎、組織(zhi)器(qi)官(guan)及外周(zhou)血(xue)，經特殊(shu)分(fen)離方(fang)法(fa)制(zhi)備(bei)而來(lai)的原初(chu)培(pei)養的(de)細胞稱之為(wei)原代細胞。1懸浮(fu)細胞的分(fen)離方(fang)法(fa)組織(zhi)材(cai)料若來(lai)自(zi)血(xue)液(ye)、羊(yang)水、胸水或腹(fu)水的懸(xuan)液(ye)材(cai)料，的方法(fa)是采用(yong)1000r/min的(de)低(di)速離(li)心(xin)10分(fen)鐘。經離心(xin)後(hou)由(you)於(yu)各(ge)種細胞的比(bi)重(zhong)不同可在分(fen)層(ceng)液中(zhong)形成不同層(ceng)，這(zhe)樣可根據(ju)需要(yao)收獲目的(de)細胞。2實體(ti)組織(zhi)材(cai)料的分(fen)離方(fang)法(fa)對(dui)於(yu)實體(ti)組織(zhi)材(cai)料，由(you)於(yu)細胞間(jian)結合(he)緊(jin)密，為了使組織(zhi)中(zhong)的細胞充分(fen)分(fen)散，形成細胞懸液(ye)，可采用(yong)機(ji)械分(fen)散法(fa)（物理(li)裂解）和消(xiao)化分(fen)離法(fa)。

三、細胞增殖檢(jian)測技(ji)術

目前(qian)主(zhu)要(yao)有兩(liang)種用(yong)於(yu)檢(jian)測細胞增殖能力(li)的方(fang)法(fa)。壹(yi)種是直(zhi)接的(de)方(fang)法(fa)，通過(guo)直(zhi)接測(ce)定進行分(fen)裂

的細胞數(shu)來(lai)評(ping)價細胞的增殖能力(li)。另(ling)壹(yi)種是間(jian)接的(de)方法(fa)，即細胞活力(li)（cell viability）檢(jian)測方(fang)法(fa)，通過(guo)檢(jian)測樣(yang)品中(zhong)健康細胞的數(shu)目來(lai)評(ping)價細胞的增殖能力(li)。顯(xian)然，細胞活力(li)檢(jian)測法(fa)並(bing)不(bu)能最終(zhong)證明(ming)檢(jian)測樣(yang)品中(zhong)的細胞是否(fou)在增殖。如細胞在某(mou)壹(yi)培(pei)養條(tiao)件下會自(zi)發(fa)啟(qi)動雕亡(wang)程(cheng)序(xu)，但(dan)藥物(wu)的幹(gan)擾可抑(yi)制(zhi)雕(diao)亡(wang)的(de)發生(sheng)；這(zhe)時若采用(yong)細胞活力(li)檢(jian)測法(fa)，顯(xian)然可以區(qu)分(fen)兩種條件(jian)下的細胞數(shu)量(liang)，但(dan)我們並(bing)不(bu)能從藥(yao)物(wu)幹(gan)擾組細胞數(shu)大於(yu)對(dui)照組的事(shi)實說(shuo)明(ming)藥物(wu)可促(cu)進(jin)細胞增殖的結(jie)論。所(suo)以最直(zhi)接的(de)證據(ju)應該(gai)采用(yong)方(fang)法(fa)壹(yi)。

取(qu)材(cai)：首(shou)先(xian)，用(yong)培(pei)養液(ye)濕潤(run)所(suo)取(qu)的組織(zhi)材(cai)料，並(bing)用(yong)鋒利的眼(yan)科剪去(qu)除附(fu)在其上(shang)的(de)脂(zhi)肪和結(jie)締組織(zhi)。接著(zhe)用(yong)平(ping)衡(heng)液(ye)（如PBS或(huo)Hanks液）漂(piao)洗(xi)，再(zai)用(yong)眼(yan)科彎(wan)剪將(jiang)組織(zhi)塊剪成小(xiao)塊。多次用(yong)PBS或(huo)Hanks液(ye)漂(piao)洗(xi)，直(zhi)到(dao)液體(ti)清(qing)亮(liang)、無(wu)油(you)滴(di)為(wei)止(zhi)。

接種：用(yong)濕潤(run)的吸(xi)管吸取(qu)切碎(sui)的組織(zhi)塊，輕(qing)輕(qing)吹到(dao)培養瓶(ping)皿(min)中(zhong)，並(bing)按(an)壹(yi)定間(jian)距均(jun)勻放在培養瓶(ping)底(di)壁(bi)上(shang)。註(zhu)意(yi)不(bu)要(yao)過多，確(que)保組織(zhi)塊切(qie)面貼在培養瓶(ping)底(di)壁(bi)上(shang)。

培養：將(jiang)培養瓶(ping)翻(fan)轉(zhuan)，使瓶(ping)底(di)朝(chao)上(shang)，在種植了組織(zhi)塊壹(yi)側(ce)的(de)對(dui)側面加(jia)足(zu)培(pei)養液(ye)，避免(mian)組織(zhi)塊與(yu)培養液(ye)接觸，然後(hou)塞(sai)緊(jin)瓶(ping)塞(sai)。將(jiang)種植了組織(zhi)塊的(de)壹(yi)側(ce)朝(chao)上(shang)，靜置於(yu)37℃培養箱中(zhong)。待組織(zhi)塊貼壁1到(dao)3小(xiao)時後(hou)翻(fan)瓶(ping)，使貼壁的(de)組織(zhi)塊浸沒在培養液(ye)中(zhong)，繼續(xu)靜置。換液(ye)：每(mei)隔2到(dao)3天更換壹(yi)次(ci)培(pei)養液(ye)，或者(zhe)根據(ju)培養瓶(ping)種顏色(se)的變(bian)化確(que)定換液時間(jian)。

壹(yi)、原代細胞計數(shu)

將血(xue)球計數(shu)板(ban)及蓋片用(yong)擦(ca)試(shi)幹(gan)凈，並(bing)將(jiang)蓋片蓋在計數(shu)板(ban)上(shang)。

將細胞懸液(ye)吸(xi)出少(shao)許(xu)，滴(di)加(jia)在蓋片邊緣，使懸(xuan)液(ye)充滿蓋片和計(ji)數(shu)板(ban)之間(jian)。

靜置3分(fen)鐘。

鏡下觀察，計算計數(shu)板(ban)四(si)大格(ge)細胞總數(shu)，壓(ya)線(xian)細胞只(zhi)計(ji)左側(ce)和上(shang)方的(de)。然後(hou)按(an)下式計算：

細胞數(shu)/ml＝4大格(ge)細胞總數(shu)/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡下偶見由(you)兩(liang)個以上細胞組成的細胞團，應按(an)單(dan)個細胞計算(suan)，若細胞團占10%以上，說明分(fen)散不好，需重(zhong)新(xin)制(zhi)備(bei)細胞懸液(ye)。

二、原代細胞活力(li)

將細胞懸液(ye)以0.5ml加(jia)入試(shi)管中(zhong)。

加(jia)入0.5ml 0.4%臺盼蘭(lan)染(ran)液，染(ran)色(se)2壹(yi)3分(fen)鐘。

吸取(qu)少(shao)許(xu)懸液(ye)塗(tu)於(yu)載玻(bo)片上，加(jia)上(shang)蓋片。

鏡下取(qu)幾(ji)個任意視(shi)野分(fen)別計(ji)死(si)細胞和活(huo)細胞數(shu)，計(ji)細胞活力(li)。

死(si)細胞能被(bei)臺盼蘭(lan)染(ran)上色(se)，鏡下可見深蘭(lan)色(se)的細胞，活細胞不被(bei)染(ran)色(se)，鏡下呈(cheng)無(wu)色(se)透明(ming)狀。

活力(li)測定可以和細胞計數(shu)合(he)起(qi)來(lai)進行(xing)，但(dan)要(yao)考(kao)慮(lv)到(dao)染(ran)液對(dui)原細胞懸液(ye)的(de)加(jia)倍(bei)稀(xi)釋作用(yong)。