【概要(yao)描(miao)述】Flag融(rong)和(he)蛋(dan)白(bai)純(chun)化(hua)試劑盒(he) Western免疫(yi)印跡(ji)(Western Blot)是(shi)將蛋白(bai)質(zhi)轉移到(dao)膜上(shang)，然(ran)後利用(yong)抗(kang)體進(jin)行(xing)檢測。

Flag融(rong)和(he)蛋(dan)白(bai)純(chun)化(hua)試劑盒(he)  Western Blot技(ji)術(shu): 做線(xian)粒(li)體膜UCP2蛋白(bai)的(de)Western Blot （以下簡寫(xie)成Western Blot），提取線(xian)粒(li)體後凍存（未加(jia)蛋白(bai)酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑），樣品(pin)不(bu)能反(fan)復凍融(rong);，加(jia)蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑。同時(shi)，建議檢查(zha)Western Blot過程(cheng)， 提(ti)高壹抗濃(nong)度(du)。對於加(jia)蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑來(lai)說(shuo)，壹般加PMSF就(jiu)可(ke)以了(le)，能多加(jia)幾(ji)中(zhong)種(zhong)蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑。
同壹(yi)蛋(dan)白(bai)樣品(pin)能同時(shi)進(jin)行(xing)兩種(zhong)因子的Western Blot檢測，有的甚(shen)至(zhi)可(ke)以同時(shi)測幾(ji)十種(zhong)樣Flag融(rong)和(he)蛋(dan)白(bai)純(chun)化(hua)試劑盒(he)如果是(shi)膜蛋白(bai)和(he)胞(bao)漿蛋(dan)白(bai)，所(suo)用(yong)的(de)去垢(gou)劑就(jiu)要(yao)溫(wen)和得多，這(zhe)時(shi)加(jia)上(shang)NaF去(qu)抑制(zhi)磷#化(hua)酶的活(huo)性。
樣品(pin)的(de)蛋(dan)白(bai)含(han)量(liang)很低，每(mei)微(wei)升不(bu)到(dao)微克(ke)，但是(shi)在轉膜時(shi)經常(chang)會發現(xian)只(zhi)有壹部(bu)分蛋白(bai)轉到(dao)了膜(mo)上，就(jiu)是(shi)在轉膜後(hou)染膠發(fa)現(xian)有的孔(kong)所(suo)有的蛋(dan)白(bai)條(tiao)帶(dai)都(dou)在，只是(shi)顏(yan)色變淡了(le)，可以加(jia)大(da)上樣量(liang)，轉移時(shi)可以用(yong)減(jian)少(shao)電(dian)流延(yan)長時(shi)間，多(duo)加5-0%甲(jia)醇。
想(xiang)分離的蛋(dan)白(bai)是(shi)分子量(liang)260kd的(de)，SDS-PAGE電泳的(de)分(fen)離膠濃(nong)度(du)用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的蛋(dan)白(bai)不(bu)好做
如(ru)果上樣量(liang)超載(zai)，可以濃(nong)縮樣品(pin)，也可以根(gen)據妳(ni)的(de)目(mu)標(biao)分(fen)子量透析(xi)掉壹(yi)部(bu)分小分子蛋白(bai)。壹(yi)般(ban)地(di)，超載(zai)30%是(shi)不(bu)會有問題的。如果已經(jing)超了不(bu)少了，而(er)且小(xiao)分子(zi)量(liang)的(de)也要(yao)，可(ke)以考慮加大(da)膠(jiao)的(de)厚(hou)度(du)，可以試(shi)試(shi).5mm的 comb。
蛋白(bai)變性(xing)後存放-80℃，壹(yi)兩(liang)年沒(mei)有問題，zui關鍵兩條(tiao)：不(bu)要(yao)被蛋白(bai)酶(mei)水解掉;不(bu)要(yao)被細菌消(xiao)化(hua)掉（也是(shi)被酶水解了(le)）。
采(cai)用(yong)DAB顯色技(ji)術(shu)，二抗是(shi)化(hua)的多克(ke)隆抗體，三(san)抗是(shi)親和素(su)體系，不(bu)能使用(yong)脫(tuo)脂(zhi)奶粉，脫(tuo)脂(zhi)奶粉會影(ying)響(xiang)親(qin)和素(su)的(de)生(sheng)成，因為脫(tuo)脂(zhi)奶粉中(zhong)含(han)，用(yong)BSA代(dai)替應(ying)該(gai)好壹點(dian).Western Blot壹般(ban)上(shang)樣30-00微(wei)克(ke)不(bu)等，結(jie)果跟(gen)目的(de)蛋(dan)白(bai)的(de)豐(feng)度(du)、上樣量(liang)、壹(yi)二(er)抗的(de)量(liang)和(he)撫(fu)育時(shi)間(jian)都有關系(xi)，也與(yu)顯色時間長短(duan)有關。開(kai)始摸條(tiao)件(jian)時(shi)，為(wei)了(le)拿(na)到(dao)陽性(xing)結(jie)果，各(ge)個(ge)步驟(zhou)都(dou)可(ke)以量(liang)多(duo)壹點時間長壹(yi)點，當(dang)然(ran)背景(jing)也就出(chu)來(lai)了(le)。要(yao)拿(na)到(dao)好的結(jie)果，如果抗體好的話(hua)比較(jiao)容(rong)易，抗體不(bu)好的話(hua)就需(xu)要(yao)反(fan)復地(di)試了(le)，當(dang)然(ran)有的不(bu)適(shi)合(he)Western Blot的(de)怎(zen)樣做(zuo)也不(bu)行(xing)。所以拿(na)到(dao)好的結(jie)果不(bu)容(rong)易。

壹、 原(yuan)理

與(yu)Southern或(huo)Northern雜交方法(fa)類(lei)似，但(dan)Western Blot采用(yong)的(de)是(shi)聚(ju)丙烯(xi)酰胺凝(ning)膠電(dian)泳，被檢測物(wu)是(shi)蛋白(bai)質(zhi)，“探針(zhen)”是(shi)抗體，“顯色”用(yong)標(biao)記(ji)的二抗。經(jing)過PAGE分離的蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣品(pin)，轉移到(dao)固相(xiang)載(zai)體（例如硝#纖維素薄(bo)膜(mo)）上，固相(xiang)載(zai)體以非(fei)共(gong)價鍵形(xing)式(shi)吸(xi)附蛋白(bai)質(zhi)，且能保持(chi)電(dian)泳分(fen)離的多(duo)肽(tai)類型及其(qi)生物學(xue)活(huo)性(xing)不(bu)變。以固(gu)相(xiang)載(zai)體上的蛋(dan)白(bai)質(zhi)或(huo)多(duo)肽(tai)作為(wei)抗(kang)原，與(yu)對應(ying)的(de)抗體起免疫(yi)反(fan)應(ying)，再與(yu)酶(mei)或(huo)同位(wei)素(su)標(biao)記(ji)的第(di)二抗(kang)體起反(fan)應(ying)，經(jing)過底(di)物(wu)顯色或(huo)放射(she)自(zi)顯影(ying)以檢(jian)測電(dian)泳分(fen)離的特異性(xing)目的(de)基因表達(da)的蛋(dan)白(bai)成分。該技(ji)術(shu)也廣泛應(ying)用(yong)於檢(jian)測蛋(dan)白(bai)水平的表(biao)達(da)。

二、分(fen)類  現常用(yong)的(de)有底(di)物(wu)化(hua)學發光(guang)ECL和底(di)物(wu)DAB呈(cheng)色，體同水平和實(shi)驗條(tiao)件(jian)的(de)是(shi)用(yong)*種(zhong)方(fang)法(fa)，目(mu)前(qian)發(fa)表文章(zhang)通常(chang)是(shi)用(yong)底(di)物(wu)化(hua)學發光(guang)ECL。只要(yao)買(mai)現成的試劑盒(he)就行(xing)，操作也比較(jiao)簡(jian)單，原理(li)如下（二抗用(yong)HRP標(biao)記(ji)）：反(fan)應(ying)底(di)物(wu)為過氧(yang)化(hua)物+魯米諾，如(ru)遇到(dao)HRP，即(ji)發光，可(ke)使膠片(pian)曝(pu)光，就(jiu)可洗(xi)出(chu)條(tiao)帶(dai)。

三(san)、 主要(yao)試(shi)劑

、 丙烯酰(xian)胺和(he)N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙(bing)烯酰(xian)胺，應(ying)以溫(wen)熱(re)（以利於溶解雙(shuang)丙(bing)稀酰胺(an)）的去離子水配制(zhi)含有29%（w/v）丙稀酰胺(an)和(he)%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙(bing)烯酰(xian)胺儲(chu)存液(ye)丙稀酰胺(an)29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉雙(shuang)丙稀酰胺(an)g，加H2O至(zhi) 00ml。）儲(chu)於棕色瓶，4℃避光(guang)保存。嚴格核(he)實(shi)PH不(bu)得超過7.0，因可以發(fa)生(sheng)脫(tuo)氨(an)基(ji)反(fan)應(ying)是(shi)光催化(hua)或(huo)堿(jian)催(cui)化(hua)的。使用(yong)期(qi)不(bu)得超過兩(liang)個(ge)月，隔(ge)幾(ji)個(ge)月須重(zhong)新配(pei)制(zhi)。如有沈澱，可以過濾(lv)。  2、 十二烷(wan)基(ji)硫#鈉SDS溶液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離子水配制(zhi)，室(shi)溫保存。

3、 分離膠緩(huan)沖(chong)液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合，加(jia)水稀釋(shi)到(dao)00ml終體積。過濾(lv)後(hou)40℃保存。

4、 濃(nong)縮膠(jiao)緩(huan)沖(chong)液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於40mlH2O中(zhong)，用(yong)約(yue)48ml mol/L HCl調至(zhi)pH6.8加水稀釋(shi)到(dao)00ml終體積。過濾(lv)後(hou)40C保存。這(zhe)兩(liang)種(zhong)緩(huan)沖(chong)液(ye)必須使用(yong)Tris堿制(zhi)備，再用(yong)HCL調節PH值，而不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原溶液(ye)N，N，N’N’四甲(jia)基乙二(er)胺(an)催(cui)化(hua)過硫#銨(an)形(xing)成自由基而(er)加速兩種(zhong)丙(bing)稀酰胺(an)的(de)聚(ju)合。PH太(tai)低時(shi)，聚(ju)合反(fan)應(ying)受(shou)到(dao)抑制(zhi)。0%（w/v）過硫#胺溶液(ye)。提供(gong)兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀酰胺(an)聚(ju)合所(suo)必須的自(zi)由基。去(qu)離子水配制(zhi)數ml，臨用(yong)前(qian)配(pei)制(zhi).

6、 SDS- PAGE加樣緩(huan)沖(chong)液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖(chong)液(ye)8ml，甘(gan)油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基乙醇(chun)3.2ml，0.05%溴酚藍.6ml，H2O 32ml混勻(yun)備(bei)用(yong)。按(an):或(huo):2比例與(yu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣品(pin)混(hun)合(he)，在沸水終煮3min混勻(yun)後(hou)再上樣，壹(yi)般(ban)為(wei)20-25ul，總蛋(dan)白(bai)量(liang)00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨(an)#電泳緩(huan)沖(chong)液(ye):30.3gTris，88g甘(gan)氨(an)#，0gSDS，用(yong)蒸餾水溶解至(zhi)000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨(an)#電極(ji)緩(huan)沖(chong)液(ye)。臨用(yong)前(qian)稀釋(shi)0倍(bei)。

8、 轉移緩(huan)沖(chong)液(ye)：配制(zhi)L轉移緩(huan)沖(chong)液(ye)，需(xu)稱取2.9g甘(gan)氨(an)#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並加(jia)入(ru)200ml甲(jia)醇，加(jia)水至(zhi)總量(liang)L。

9、 麗春(chun)紅(hong)染液(ye)儲(chu)存液(ye)：麗春(chun)紅(hong)S 2g 三(san)#乙#30g 磺(huang)基(ji)水楊(yang)# 30g 加水至(zhi)00ml 用(yong)時(shi)上述(shu)儲(chu)存液(ye)稀釋(shi)0倍(bei)即(ji)成麗春(chun)紅(hong)S使用(yong)液(ye)。使用(yong)後(hou)應(ying)予(yu)以廢(fei)棄(qi)。

0、 脫(tuo)脂(zhi)奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(na)（有毒，戴(dai)手套(tao)操作），溶於磷(lin)#緩沖(chong)鹽(yan)溶液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖(chong)鹽(yan)溶液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗人-MMP-9（6）鼠抗人-TIMP-。

4、 過氧(yang)化(hua)物酶標(biao)記(ji)的第(di)二抗(kang)體。

5、 NBT（溶於70%二甲(jia)基甲(jia)酰胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於00%二甲(jia)基甲(jia)酰胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。