【概要(yao)描(miao)述(shu)】His6 融和(he)蛋(dan)白(bai)純化(hua)試(shi)劑盒 Western免疫印(yin)跡(Western Blot)是(shi)將蛋白(bai)質(zhi)轉(zhuan)移到(dao)膜上，然(ran)後利用(yong)抗(kang)體(ti)進(jin)行(xing)檢(jian)測。

GST融和(he)蛋(dan)白(bai)純化(hua)試(shi)劑盒    Western Blot技術: 做(zuo)線粒體(ti)膜(mo)UCP2蛋白(bai)的Western Blot （以(yi)下簡寫成Western Blot），提(ti)取線粒體(ti)後凍存（未加蛋白(bai)酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑），樣(yang)品(pin)不能(neng)反(fan)復(fu)凍融;，加蛋白(bai)酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑。同(tong)時(shi)，建議檢(jian)查Western Blot過程(cheng)， 提(ti)高壹(yi)抗(kang)濃度(du)。對於(yu)加蛋白(bai)酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑來說(shuo)，壹(yi)般加PMSF就可(ke)以(yi)了，能(neng)多(duo)加幾中種蛋白(bai)酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑。
同(tong)壹(yi)蛋(dan)白(bai)樣(yang)品(pin)能(neng)同(tong)時(shi)進(jin)行(xing)兩(liang)種(zhong)因子的Western Blot檢(jian)測，有(you)的甚(shen)至可(ke)以(yi)同(tong)時(shi)測幾(ji)十種樣(yang)GST融和(he)蛋(dan)白(bai)純化(hua)試(shi)劑盒如果是膜(mo)蛋白(bai)和(he)胞漿蛋(dan)白(bai)，所(suo)用(yong)的去(qu)垢劑就要(yao)溫和(he)得多(duo)，這時(shi)加上NaF去(qu)抑制(zhi)磷#化(hua)酶(mei)的活性(xing)。
樣(yang)品(pin)的蛋(dan)白(bai)含(han)量(liang)很低，每微(wei)升不(bu)到(dao)微克(ke)，但(dan)是在轉(zhuan)膜(mo)時(shi)經(jing)常(chang)會發(fa)現只(zhi)有壹部分蛋白(bai)轉(zhuan)到(dao)了膜上，就是(shi)在轉(zhuan)膜(mo)後染膠(jiao)發(fa)現有(you)的孔所(suo)有(you)的蛋(dan)白(bai)條(tiao)帶(dai)都(dou)在，只(zhi)是顏色變淡了，可(ke)以(yi)加大上樣(yang)量(liang)，轉(zhuan)移時(shi)可(ke)以(yi)用(yong)減(jian)少電流(liu)延(yan)長(chang)時(shi)間(jian)，多(duo)加5-0%甲醇(chun)。
想(xiang)分離的蛋(dan)白(bai)是(shi)分子量(liang)260kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度(du)用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的蛋(dan)白(bai)不(bu)好做(zuo)
如果上樣(yang)量(liang)超載，可(ke)以(yi)濃縮(suo)樣(yang)品(pin)，也可(ke)以(yi)根(gen)據妳的目標分子量(liang)透析(xi)掉壹(yi)部分小分子蛋白(bai)。壹(yi)般地，超載30%是(shi)不會有(you)問題(ti)的。如(ru)果已經(jing)超了不少了，而(er)且小分子量(liang)的也要(yao)，可(ke)以(yi)考(kao)慮加大膠的厚度(du)，可(ke)以(yi)試(shi)試(shi).5mm的 comb。
蛋(dan)白(bai)變性後存放-80℃，壹兩(liang)年沒(mei)有問題(ti)，zui關(guan)鍵(jian)兩(liang)條(tiao)：不(bu)要(yao)被(bei)蛋白(bai)酶(mei)水解掉;不(bu)要(yao)被(bei)細菌消(xiao)化(hua)掉（也是被(bei)酶(mei)水解了）。
采用(yong)DAB顯(xian)色(se)技術，二抗(kang)是(shi)化(hua)的多(duo)克(ke)隆(long)抗(kang)體(ti)，三(san)抗(kang)是(shi)親(qin)和(he)素(su)體系(xi)，不(bu)能(neng)使用(yong)脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉(fen)，脫脂(zhi)奶(nai)粉(fen)會影(ying)響(xiang)親和(he)素(su)的生(sheng)成，因為(wei)脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉(fen)中含(han)，用(yong)BSA代(dai)替應(ying)該好壹點(dian).GST融和(he)蛋(dan)白(bai)純化(hua)試(shi)劑盒Western Blot壹般上樣(yang)30-00微(wei)克(ke)不(bu)等，結果跟目的蛋(dan)白(bai)的豐(feng)度(du)、上樣(yang)量(liang)、壹二抗(kang)的量(liang)和撫育時(shi)間(jian)都(dou)有(you)關(guan)系(xi)，也與(yu)顯色時(shi)間(jian)長(chang)短(duan)有(you)關(guan)。開始(shi)摸條(tiao)件時(shi)，為(wei)了拿到(dao)陽(yang)性(xing)結(jie)果，各(ge)個步驟(zhou)都(dou)可(ke)以(yi)量(liang)多(duo)壹(yi)點(dian)時(shi)間(jian)長(chang)壹(yi)點，當(dang)然(ran)背(bei)景也就出(chu)來了。要(yao)拿(na)到(dao)好的結(jie)果，如果抗(kang)體(ti)好的話(hua)比較容(rong)易(yi)，抗(kang)體(ti)不(bu)好的話(hua)就需(xu)要(yao)反(fan)復(fu)地試(shi)了，當然(ran)有(you)的不(bu)適(shi)合Western Blot的怎樣(yang)做(zuo)也不行(xing)。所(suo)以(yi)拿到(dao)好的結(jie)果不容(rong)易(yi)。

GST融和(he)蛋(dan)白(bai)純化(hua)試(shi)劑盒壹、 原(yuan)理(li)

與(yu)Southern或(huo)Northern雜(za)交方法(fa)類似(si)，但(dan)Western Blot采(cai)用(yong)的是(shi)聚丙烯(xi)酰胺凝(ning)膠電泳，被(bei)檢(jian)測物(wu)是蛋(dan)白(bai)質(zhi)，“探(tan)針(zhen)”是(shi)抗(kang)體(ti)，“顯色(se)”用(yong)標記(ji)的二(er)抗(kang)。經(jing)過(guo)PAGE分離的蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣(yang)品(pin)，轉(zhuan)移到(dao)固(gu)相載(zai)體（例如(ru)硝#纖(xian)維素(su)薄膜(mo)）上，固(gu)相載(zai)體以(yi)非共價(jia)鍵(jian)形(xing)式(shi)吸附(fu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)，且能(neng)保(bao)持(chi)電泳分離的多(duo)肽類型(xing)及(ji)其(qi)生物學(xue)活性(xing)不(bu)變。以固(gu)相載(zai)體上的蛋(dan)白(bai)質(zhi)或(huo)多(duo)肽作為(wei)抗(kang)原(yuan)，與(yu)對應的抗(kang)體(ti)起(qi)免(mian)疫反(fan)應(ying)，再與(yu)酶(mei)或(huo)同(tong)位素(su)標記(ji)的第(di)二抗(kang)體(ti)起(qi)反(fan)應，經(jing)過(guo)底物顯(xian)色或(huo)放(fang)射(she)自(zi)顯(xian)影(ying)以(yi)檢(jian)測電泳分離的特(te)異性(xing)目的基(ji)因表(biao)達的蛋(dan)白(bai)成(cheng)分。該技術也廣(guang)泛(fan)應用(yong)於(yu)檢(jian)測蛋(dan)白(bai)水平的表(biao)達。

二、分類  現(xian)常用(yong)的有(you)底物化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)ECL和底物DAB呈色(se)，體(ti)同(tong)水平和實驗條(tiao)件的是(shi)用(yong)*種(zhong)方(fang)法(fa)，目前發(fa)表(biao)文章(zhang)通常(chang)是(shi)用(yong)底物化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)ECL。只(zhi)要(yao)買(mai)現(xian)成的試(shi)劑盒就行(xing)，操作也比較簡單，原(yuan)理(li)如(ru)下(xia)（二(er)抗(kang)用(yong)HRP標記(ji)）：反(fan)應(ying)底物為(wei)過(guo)氧化(hua)物+魯(lu)米(mi)諾，如(ru)遇到(dao)HRP，即發(fa)光(guang)，可(ke)使膠片(pian)曝光(guang)，就可(ke)洗出(chu)條帶(dai)。

三、 主要(yao)試(shi)劑

、 丙烯(xi)酰胺和(he)N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙烯(xi)酰胺，應(ying)以溫熱(re)（以(yi)利(li)於(yu)溶(rong)解雙(shuang)丙稀(xi)酰胺）的去(qu)離子(zi)水配制(zhi)含(han)有(you)29%（w/v）丙稀(xi)酰胺和(he)%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙烯(xi)酰胺儲(chu)存液(ye)丙稀(xi)酰胺29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉(cha)雙丙稀(xi)酰胺g，加H2O至 00ml。）儲於(yu)棕(zong)色(se)瓶，4℃避(bi)光(guang)保(bao)存。嚴格(ge)核(he)實PH不(bu)得超過7.0，因可(ke)以(yi)發(fa)生脫(tuo)氨(an)基(ji)反應(ying)是光(guang)催(cui)化(hua)或(huo)堿(jian)催(cui)化(hua)的。使用(yong)期不(bu)得(de)超過兩(liang)個(ge)月，隔(ge)幾個(ge)月須重(zhong)新(xin)配制(zhi)。如(ru)有(you)沈澱，可(ke)以(yi)過(guo)濾。  2、 十二烷(wan)基(ji)硫(liu)#鈉(na)SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離子(zi)水配制(zhi)，室(shi)溫保(bao)存。

3、 分離膠緩沖(chong)液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混(hun)合(he)，加水稀(xi)釋到(dao)00ml終(zhong)體(ti)積。過濾後40℃保存。

4、 濃縮(suo)膠(jiao)緩沖(chong)液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於(yu)40mlH2O中(zhong)，用(yong)約(yue)48ml mol/L HCl調至pH6.8加水稀(xi)釋到(dao)00ml終(zhong)體(ti)積。過濾後40C保存。這兩(liang)種(zhong)緩(huan)沖(chong)液(ye)必須使用(yong)Tris堿(jian)制備(bei)，再用(yong)HCL調(tiao)節PH值，而(er)不用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液(ye)N，N，N’N’四(si)甲基(ji)乙二(er)胺催(cui)化(hua)過硫(liu)#銨形(xing)成自(zi)由基(ji)而(er)加速(su)兩(liang)種(zhong)丙稀(xi)酰胺的聚(ju)合。PH太(tai)低時(shi)，聚合(he)反(fan)應(ying)受到(dao)抑制。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺溶(rong)液(ye)。提(ti)供(gong)兩(liang)種(zhong)丙稀(xi)酰胺聚(ju)合所(suo)必須的自(zi)由基(ji)。去(qu)離子(zi)水配制(zhi)數(shu)ml，臨用(yong)前(qian)配制(zhi).

6、 SDS- PAGE加樣(yang)緩(huan)沖(chong)液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖液(ye)8ml，甘(gan)油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基(ji)乙醇(chun)3.2ml，0.05%溴(xiu)酚(fen)藍.6ml，H2O 32ml混勻(yun)備(bei)用(yong)。按(an):或(huo):2比例與(yu)蛋白(bai)質(zhi)樣(yang)品(pin)混合(he)，在沸(fei)水終煮(zhu)3min混(hun)勻(yun)後再上樣(yang)，壹(yi)般為(wei)20-25ul，總(zong)蛋白(bai)量(liang)00μg。

7、 Tris-甘氨#電泳緩(huan)沖液(ye):30.3gTris，88g甘氨(an)#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾水溶(rong)解至(zhi)000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極(ji)緩沖(chong)液(ye)。臨用(yong)前(qian)稀(xi)釋0倍。

8、 轉(zhuan)移緩沖(chong)液(ye)：配制(zhi)L轉(zhuan)移緩沖(chong)液(ye)，需稱取2.9g甘氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入(ru)200ml甲醇(chun)，加水至總量(liang)L。

9、 麗春(chun)紅染(ran)液(ye)儲存液(ye)：麗春紅S 2g 三(san)#乙#30g 磺(huang)基(ji)水楊# 30g 加水至00ml 用(yong)時(shi)上述(shu)儲存液(ye)稀(xi)釋0倍即成麗春(chun)紅S使用(yong)液(ye)。使用(yong)後應予(yu)以(yi)廢棄。

0、 脫脂(zhi)奶(nai)粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮(dan)鈉(na)（有毒，戴手(shou)套操作），溶(rong)於(yu)磷#緩沖鹽(yan)溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖鹽(yan)溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗(kang)人(ren)-MMP-9（6）鼠抗(kang)人(ren)-TIMP-。

4、 過(guo)氧(yang)化(hua)物酶(mei)標記(ji)的第(di)二抗(kang)體(ti)。

5、 NBT（溶(rong)於(yu)70%二(er)甲基(ji)甲酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於(yu)00%二(er)甲基(ji)甲酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。