【概(gai)要(yao)描(miao)述】N,N-亞(ya)甲(jia)基(ji)雙(shuang)丙烯酰(xian)胺(an)（別(bie)名(ming)甲叉雙(shuang)丙烯酰(xian)胺(an)）Western Blot)是將(jiang)蛋白質(zhi)轉移到膜(mo)上(shang)，然後(hou)利用(yong)抗體(ti)進行(xing)檢測。

N,N-亞(ya)甲(jia)基(ji)雙(shuang)丙烯酰(xian)胺(an)（別(bie)名(ming)甲叉雙(shuang)丙烯酰(xian)胺(an)）Western Blot技(ji)術:

壹、 原(yuan)理

與(yu)Southern或(huo)Northern雜交(jiao)方(fang)法(fa)類似，但(dan)Western Blot采(cai)用(yong)的是聚丙烯酰(xian)胺(an)凝膠(jiao)電泳，被(bei)檢測物(wu)是蛋白質(zhi)，“探針(zhen)”是抗體(ti)，“顯(xian)色(se)”用(yong)標記的(de)二抗(kang)。經(jing)過PAGE分離(li)的蛋白質(zhi)樣品，轉移到固相(xiang)載(zai)體（例(li)如硝#纖(xian)維(wei)素(su)薄膜(mo)）上(shang)，固(gu)相(xiang)載體(ti)以(yi)非(fei)共(gong)價(jia)鍵(jian)形式(shi)吸附(fu)蛋白質(zhi)，且能保(bao)持(chi)電泳分(fen)離(li)的多(duo)肽類(lei)型及其生物(wu)學活性(xing)不變。以(yi)固(gu)相(xiang)載(zai)體上(shang)的(de)蛋白質(zhi)或多(duo)肽作(zuo)為抗(kang)原(yuan)，與(yu)對(dui)應(ying)的(de)抗(kang)體起免疫(yi)反(fan)應，再(zai)與(yu)酶或(huo)同位素(su)標記的(de)第(di)二抗(kang)體(ti)起反(fan)應，經(jing)過底物顯色(se)或放射(she)自顯影以(yi)檢測電泳分(fen)離(li)的特異(yi)性目的基因(yin)表達(da)的蛋白成(cheng)分(fen)。該技術也廣泛(fan)應用(yong)於檢測蛋白水平(ping)的(de)表達(da)。

二、分(fen)類(lei)N,N-亞(ya)甲(jia)基(ji)雙(shuang)丙烯酰(xian)胺(an)（別(bie)名(ming)甲叉雙(shuang)丙烯酰(xian)胺(an)）現(xian)常(chang)用(yong)的有底物化學發光ECL和(he)底物DAB呈色(se)，體同水平(ping)和(he)實(shi)驗條件的(de)是用(yong)*種方(fang)法(fa)，目前(qian)發表文(wen)章通常是用(yong)底物化學發光ECL。只(zhi)要(yao)買現成(cheng)的(de)試(shi)劑(ji)盒(he)就(jiu)行(xing)，操(cao)作(zuo)也比(bi)較(jiao)簡單(dan)，原(yuan)理如(ru)下（二抗(kang)用(yong)HRP標記）：反(fan)應底物為過(guo)氧化物(wu)+魯米(mi)諾，如(ru)遇(yu)到HRP，即發光，可使膠片曝光，就(jiu)可洗出(chu)條(tiao)帶(dai)。

三、 主要(yao)試(shi)劑(ji)

、 丙烯酰(xian)胺(an)和(he)N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙烯酰(xian)胺(an)，應(ying)以(yi)溫熱(re)（以(yi)利(li)於溶(rong)解(jie)雙(shuang)丙稀酰(xian)胺(an)）的(de)去離(li)子(zi)水配(pei)制含(han)有29%（w/v）丙稀酰(xian)胺(an)和(he)%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙烯酰(xian)胺(an)儲(chu)存液(ye)丙稀酰(xian)胺(an)29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉(cha)雙(shuang)丙稀酰(xian)胺(an)g，加(jia)H2O至 00ml。）儲於棕色(se)瓶(ping)，4℃避光保(bao)存。嚴(yan)格核(he)實(shi)PH不得超過7.0，因(yin)可以(yi)發生脫(tuo)氨基(ji)反(fan)應是光催(cui)化或堿催(cui)化的。使用(yong)期不得超過兩個(ge)月，隔(ge)幾(ji)個(ge)月(yue)須重新配制。如有沈澱(dian)，可以(yi)過(guo)濾(lv)。（別(bie)名(ming)甲叉雙(shuang)丙烯酰(xian)胺(an)）2、 十(shi)二烷(wan)基(ji)硫#鈉SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離(li)子(zi)水配(pei)制，室溫保(bao)存。

3、 分(fen)離(li)膠緩(huan)沖(chong)液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混合，加(jia)水稀(xi)釋(shi)到00ml終(zhong)體積(ji)。過(guo)濾(lv)後(hou)40℃保(bao)存。

4、 濃縮膠(jiao)緩(huan)沖(chong)液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於40mlH2O中，用(yong)約(yue)48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加水稀(xi)釋(shi)到00ml終(zhong)體積(ji)。過(guo)濾(lv)後(hou)40C保(bao)存。這(zhe)兩種(zhong)緩(huan)沖(chong)液(ye)必須(xu)使用(yong)Tris堿制備，再(zai)用(yong)HCL調節(jie)PH值(zhi)，而(er)不用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液(ye)N，N，N’N’四甲(jia)基(ji)乙(yi)二胺(an)催(cui)化過硫(liu)#銨(an)形成自由(you)基(ji)而加(jia)速兩種(zhong)丙稀酰(xian)胺(an)的(de)聚合。PH太(tai)低時(shi)，聚合反(fan)應受(shou)到抑(yi)制。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺溶(rong)液(ye)。提供(gong)兩(liang)種(zhong)丙稀酰(xian)胺(an)聚合所(suo)必須(xu)的(de)自由(you)基(ji)。去離(li)子(zi)水配(pei)制數(shu)ml，臨用(yong)前(qian)配制.

6、 SDS- PAGE加樣緩(huan)沖(chong)液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖(chong)液(ye)8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚(fen)藍.6ml，H2O 32ml混勻(yun)備用(yong)。按:或(huo):2比(bi)例(li)與(yu)蛋白質(zhi)樣品混合，在(zai)沸(fei)水終(zhong)煮(zhu)3min混勻(yun)後(hou)再上(shang)樣，壹般(ban)為20-25ul，總蛋白量(liang)00μg。

7、 Tris-甘氨#電泳緩(huan)沖(chong)液(ye):30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾水溶(rong)解(jie)至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極(ji)緩(huan)沖(chong)液(ye)。臨用(yong)前(qian)稀釋(shi)0倍(bei)。

8、 轉移緩(huan)沖(chong)液(ye)：配制L轉(zhuan)移緩(huan)沖(chong)液(ye)，需(xu)稱取(qu)2.9g甘氨#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並(bing)加入200ml甲醇，加水至總(zong)量(liang)L。

9、 麗春(chun)紅(hong)染液(ye)儲存液(ye)：麗春(chun)紅(hong)S 2g 三#乙(yi)#30g 磺(huang)基水楊# 30g 加(jia)水至00ml 用(yong)時上(shang)述(shu)儲(chu)存液(ye)稀釋(shi)0倍(bei)即成麗(li)春(chun)紅(hong)S使用(yong)液(ye)。使用(yong)後(hou)應予(yu)以(yi)廢(fei)棄。

0、 脫(tuo)脂奶(nai)粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉(na)（有毒，戴手(shou)套(tao)操(cao)作(zuo)），溶(rong)於磷#緩(huan)沖(chong)鹽溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖(chong)鹽溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗人(ren)-MMP-9（6）鼠抗人(ren)-TIMP-。

4、 過(guo)氧化物(wu)酶標記的(de)第(di)二抗(kang)體(ti)。

5、 NBT（溶(rong)於70%二甲(jia)基(ji)甲酰(xian)胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於00%二甲(jia)基(ji)甲酰(xian)胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。