【概要(yao)描述(shu)】增(zeng)強(qiang)型(xing)化學發(fa)光(guang)試劑(ECL) Western免(mian)疫(yi)印(yin)跡(ji)(Western Blot)是(shi)將(jiang)蛋(dan)白(bai)質(zhi)轉(zhuan)移(yi)到膜上，然(ran)後(hou)利用(yong)抗(kang)體進(jin)行檢測。

增(zeng)強(qiang)型(xing)化學發(fa)光(guang)試劑（ECL）   Western Blot技(ji)術(shu): 做線(xian)粒(li)體(ti)膜UCP2蛋(dan)白(bai)的Western Blot （以(yi)下簡(jian)寫成Western Blot），提(ti)取線(xian)粒(li)體(ti)後(hou)凍(dong)存（未(wei)加蛋(dan)白(bai)酶抑制(zhi)劑），樣(yang)品(pin)不能(neng)反(fan)復(fu)凍(dong)融;，加(jia)蛋(dan)白(bai)酶抑制(zhi)劑。同(tong)時，建(jian)議(yi)檢查(zha)Western Blot過程(cheng)， 提(ti)高壹(yi)抗(kang)濃度。對於(yu)加(jia)蛋(dan)白(bai)酶抑制(zhi)劑來說(shuo)，壹(yi)般(ban)加PMSF就可(ke)以了，能(neng)多(duo)加幾(ji)中種(zhong)蛋(dan)白(bai)酶抑制(zhi)劑。
同(tong)壹(yi)蛋(dan)白(bai)樣(yang)品(pin)能(neng)同(tong)時進(jin)行(xing)兩(liang)種(zhong)因子(zi)的Western Blot檢測，有(you)的(de)甚(shen)至可(ke)以同(tong)時測(ce)幾(ji)十種(zhong)樣(yang)增(zeng)強(qiang)型(xing)化學發(fa)光(guang)試劑（ECL） 如果(guo)是(shi)膜蛋(dan)白(bai)和胞漿蛋(dan)白(bai)，所用(yong)的(de)去(qu)垢劑就要溫(wen)和得(de)多(duo)，這時加上NaF去抑制(zhi)磷(lin)#化酶的(de)活(huo)性(xing)。
樣(yang)品(pin)的(de)蛋(dan)白(bai)含量很低(di)，每(mei)微升(sheng)不到微克(ke)，但(dan)是(shi)在(zai)轉(zhuan)膜時經常(chang)會發(fa)現(xian)只有(you)壹(yi)部(bu)分蛋(dan)白(bai)轉(zhuan)到了膜上，就是(shi)在(zai)轉(zhuan)膜後(hou)染膠(jiao)發(fa)現(xian)有(you)的(de)孔所有(you)的(de)蛋(dan)白(bai)條帶都(dou)在(zai)，只是(shi)顏色(se)變(bian)淡了，可(ke)以加(jia)大上樣(yang)量，轉(zhuan)移(yi)時(shi)可(ke)以用(yong)減少電(dian)流(liu)延(yan)長時間，多(duo)加5-0%甲醇。
想分離(li)的(de)蛋(dan)白(bai)是(shi)分子(zi)量260kd的，SDS-PAGE電(dian)泳(yong)的分離(li)膠(jiao)濃度用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的(de)蛋(dan)白(bai)不好(hao)做
如(ru)果(guo)上樣(yang)量超載，可(ke)以濃縮樣(yang)品(pin)，也(ye)可(ke)以根(gen)據(ju)妳(ni)的目(mu)標(biao)分子(zi)量透析掉壹(yi)部(bu)分小分子(zi)蛋(dan)白(bai)。壹(yi)般(ban)地，超(chao)載30%是(shi)不會有(you)問(wen)題的(de)。如(ru)果(guo)已(yi)經超(chao)了不少了，而(er)且小分子(zi)量的也要，可(ke)以考(kao)慮加大膠的厚度(du)，可(ke)以試(shi)試.5mm的 comb。
蛋(dan)白(bai)變性(xing)後(hou)存放(fang)-80℃，壹(yi)兩(liang)年沒(mei)有(you)問(wen)題，zui關鍵兩(liang)條：不要(yao)被(bei)蛋(dan)白(bai)酶水(shui)解掉(diao);不要(yao)被(bei)細菌(jun)消(xiao)化掉（也(ye)是(shi)被(bei)酶水(shui)解了）。
采(cai)用(yong)DAB顯(xian)色(se)技(ji)術(shu)，二抗(kang)是(shi)化的多(duo)克(ke)隆(long)抗(kang)體，三抗(kang)是(shi)親(qin)和素(su)體(ti)系(xi)，不能(neng)使(shi)用(yong)脫(tuo)脂奶(nai)粉，脫(tuo)脂奶(nai)粉會影響親和素(su)的(de)生(sheng)成，因為脫(tuo)脂奶(nai)粉中含，用(yong)BSA代替應該好(hao)壹(yi)點. Western Blot壹(yi)般(ban)上樣(yang)30-00微克(ke)不等(deng)，結(jie)果(guo)跟(gen)目(mu)的(de)蛋(dan)白(bai)的豐(feng)度(du)、上樣(yang)量、壹(yi)二抗(kang)的量和撫(fu)育(yu)時(shi)間(jian)都(dou)有(you)關系，也與顯(xian)色(se)時(shi)間(jian)長(chang)短有(you)關。開(kai)始(shi)摸(mo)條(tiao)件(jian)時，為了拿到陽(yang)性(xing)結(jie)果(guo)，各(ge)個步(bu)驟(zhou)都(dou)可(ke)以量多(duo)壹(yi)點時間長壹(yi)點，當然(ran)背景(jing)也(ye)就出(chu)來(lai)了。要拿到好(hao)的(de)結(jie)果(guo)，如(ru)果(guo)抗(kang)體好(hao)的(de)話比(bi)較容(rong)易，抗(kang)體不好(hao)的(de)話就需(xu)要反(fan)復(fu)地(di)試(shi)了，當然(ran)有(you)的(de)不適合(he)Western Blot的(de)怎樣(yang)做也(ye)不行(xing)。所以拿到好(hao)的(de)結(jie)果(guo)不容(rong)易。

 壹(yi)、 原(yuan)理

與(yu)Southern或(huo)Northern雜交方(fang)法(fa)類(lei)似(si)，但(dan)Western Blot采(cai)用(yong)的(de)是(shi)聚丙烯(xi)酰(xian)胺凝膠電(dian)泳(yong)，被(bei)檢測物(wu)是(shi)蛋(dan)白(bai)質(zhi)，“探(tan)針”是(shi)抗(kang)體，“顯(xian)色(se)”用(yong)標(biao)記(ji)的(de)二抗(kang)。經過(guo)PAGE分離(li)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣(yang)品(pin)，轉(zhuan)移(yi)到固(gu)相載體(ti)（例(li)如硝(xiao)#纖(xian)維素薄(bo)膜）上，固(gu)相載體(ti)以(yi)非(fei)共價鍵(jian)形式吸附蛋(dan)白(bai)質(zhi)，且能(neng)保持電(dian)泳(yong)分離(li)的(de)多(duo)肽(tai)類(lei)型(xing)及(ji)其(qi)生(sheng)物(wu)學(xue)活性(xing)不變(bian)。以(yi)固(gu)相載體(ti)上的蛋(dan)白(bai)質(zhi)或多(duo)肽(tai)作為抗(kang)原，與(yu)對應的抗(kang)體起(qi)免(mian)疫(yi)反(fan)應(ying)，再(zai)與(yu)酶(mei)或同(tong)位素(su)標(biao)記(ji)的第二抗(kang)體起(qi)反(fan)應(ying)，經過(guo)底(di)物(wu)顯(xian)色(se)或(huo)放(fang)射(she)自顯(xian)影以檢測電(dian)泳(yong)分離(li)的(de)特(te)異(yi)性(xing)目(mu)的(de)基因表達(da)的(de)蛋(dan)白(bai)成分。該技(ji)術(shu)也廣(guang)泛應用(yong)於(yu)檢測蛋(dan)白(bai)水(shui)平(ping)的(de)表(biao)達(da)。

二、分類(lei)  現(xian)常(chang)用(yong)的(de)有(you)底(di)物(wu)化學發(fa)光(guang)ECL和底(di)物(wu)DAB呈(cheng)色(se)，體(ti)同(tong)水(shui)平(ping)和實(shi)驗條(tiao)件(jian)的是(shi)用(yong)*種(zhong)方(fang)法(fa)，目(mu)前(qian)發表文章(zhang)通常(chang)是(shi)用(yong)底(di)物(wu)化學發(fa)光(guang)ECL。只(zhi)要買現(xian)成的試劑盒就行，操作(zuo)也比(bi)較簡(jian)單(dan)，原理如(ru)下(xia)（二抗(kang)用(yong)HRP標(biao)記）：反(fan)應(ying)底(di)物(wu)為過氧化物(wu)+魯(lu)米諾(nuo)，如(ru)遇到HRP，即(ji)發光(guang)，可(ke)使(shi)膠(jiao)片(pian)曝光(guang)，就可(ke)洗出(chu)條(tiao)帶。

三、 主(zhu)要試劑

、 丙烯(xi)酰(xian)胺和N，N’-亞(ya)甲雙丙烯(xi)酰(xian)胺，應以(yi)溫(wen)熱(re)（以(yi)利於(yu)溶解(jie)雙丙稀(xi)酰(xian)胺）的(de)去離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制含(han)有(you)29%（w/v）丙稀(xi)酰(xian)胺和%（w/v）N，N’-亞(ya)甲雙丙烯(xi)酰(xian)胺儲存液(ye)丙稀(xi)酰(xian)胺29g，N，N-亞(ya)甲叉(cha)雙丙稀(xi)酰(xian)胺g，加(jia)H2O至 00ml。）儲(chu)於(yu)棕(zong)色(se)瓶(ping)，4℃避(bi)光(guang)保存。嚴(yan)格核(he)實(shi)PH不得(de)超(chao)過7.0，因(yin)可(ke)以發(fa)生脫(tuo)氨基(ji)反(fan)應(ying)是(shi)光(guang)催(cui)化或堿(jian)催(cui)化的。使(shi)用(yong)期(qi)不得(de)超(chao)過兩(liang)個月(yue)，隔(ge)幾(ji)個月(yue)須重(zhong)新配(pei)制。如(ru)有(you)沈澱，可(ke)以過(guo)濾。  2、 十二烷基(ji)硫(liu)#鈉SDS溶液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制，室溫(wen)保存。

3、 分離(li)膠(jiao)緩沖液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合(he)，加(jia)水(shui)稀(xi)釋(shi)到00ml終體積(ji)。過濾後(hou)40℃保存。

4、 濃縮膠緩沖液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於(yu)40mlH2O中，用(yong)約(yue)48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加(jia)水(shui)稀(xi)釋(shi)到00ml終體積(ji)。過濾後(hou)40C保存。這(zhe)兩(liang)種(zhong)緩沖液(ye)必(bi)須使(shi)用(yong)Tris堿(jian)制(zhi)備，再用(yong)HCL調(tiao)節PH值(zhi)，而(er)不用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶液(ye)N，N，N’N’四甲(jia)基乙(yi)二胺催(cui)化過硫(liu)#銨形成自由(you)基(ji)而(er)加速(su)兩(liang)種(zhong)丙稀(xi)酰(xian)胺的聚合。PH太低(di)時(shi)，聚合反(fan)應(ying)受(shou)到抑制(zhi)。0%（w/v）過(guo)硫#胺溶液(ye)。提(ti)供(gong)兩(liang)種(zhong)丙稀(xi)酰(xian)胺聚合所必須的(de)自由(you)基(ji)。去離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制數(shu)ml，臨用(yong)前(qian)配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加(jia)樣(yang)緩沖液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液(ye)8ml，甘(gan)油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚藍(lan).6ml，H2O 32ml混勻(yun)備用(yong)。按(an):或(huo):2比(bi)例與(yu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣(yang)品(pin)混合(he)，在(zai)沸(fei)水(shui)終煮(zhu)3min混勻(yun)後(hou)再上樣(yang)，壹(yi)般(ban)為20-25ul，總蛋(dan)白(bai)量00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨#電(dian)泳(yong)緩沖液(ye):30.3gTris，88g甘(gan)氨#，0gSDS，用(yong)蒸餾水(shui)溶解(jie)至000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨#電(dian)極緩沖液(ye)。臨用(yong)前(qian)稀(xi)釋(shi)0倍(bei)。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩沖液(ye)：配(pei)制L轉(zhuan)移(yi)緩沖液(ye)，需(xu)稱(cheng)取2.9g甘(gan)氨#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入(ru)200ml甲(jia)醇，加(jia)水(shui)至總量L。

9、 麗(li)春紅染(ran)液儲存液(ye)：麗春紅S 2g 三#乙(yi)#30g 磺(huang)基水(shui)楊# 30g 加(jia)水(shui)至00ml 用(yong)時(shi)上述(shu)儲(chu)存液(ye)稀(xi)釋(shi)0倍(bei)即成麗春紅S使(shi)用(yong)液(ye)。使(shi)用(yong)後(hou)應予(yu)以廢(fei)棄(qi)。

0、 脫(tuo)脂奶(nai)粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮(dan)鈉（有(you)毒，戴(dai)手套(tao)操(cao)作(zuo)），溶於(yu)磷(lin)#緩沖鹽(yan)溶液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖鹽(yan)溶液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗(kang)人-MMP-9（6）鼠(shu)抗(kang)人-TIMP-。

4、 過(guo)氧化物(wu)酶(mei)標記的第(di)二抗(kang)體。

5、 NBT（溶於(yu)70%二甲基甲酰(xian)胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於(yu)00%二甲基甲酰(xian)胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。