【概(gai)要描述】5ⅹWestern Blot 膜(mo)封閉液(ye) Western Blot)是(shi)將蛋(dan)白質轉移到膜(mo)上(shang)，然(ran)後利用抗(kang)體(ti)進(jin)行(xing)檢測(ce)。

5ⅹWestern Blot 膜(mo)封閉液(ye) Western Blot技術(shu):

壹、 原理(li)

與Southern或Northern雜交(jiao)方(fang)法類似，但(dan)Western Blot采用的是(shi)聚丙(bing)烯酰胺(an)凝膠(jiao)電泳，被檢測(ce)物是(shi)蛋白質，“探(tan)針(zhen)”是(shi)抗體(ti)，“顯(xian)色(se)”用標(biao)記的二抗(kang)。經(jing)過PAGE分(fen)離的蛋(dan)白質樣品，轉(zhuan)移到固(gu)相(xiang)載體（例(li)如硝(xiao)#纖維(wei)素(su)薄(bo)膜(mo)）上(shang)，固(gu)相(xiang)載體以(yi)非(fei)共價鍵形式吸(xi)附蛋白質，且能(neng)保持電泳分(fen)離的多(duo)肽類型及其生(sheng)物(wu)學活性不(bu)變(bian)。以(yi)固(gu)相(xiang)載體上(shang)的蛋(dan)白質或多肽作為(wei)抗原，與對(dui)應的抗(kang)體起(qi)免疫(yi)反(fan)應，再(zai)與酶或同位(wei)素(su)標(biao)記的第二抗(kang)體(ti)起(qi)反(fan)應，經(jing)過(guo)底(di)物顯(xian)色(se)或放射自顯(xian)影(ying)以(yi)檢測(ce)電泳分(fen)離的特(te)異(yi)性目(mu)的基因(yin)表(biao)達的蛋(dan)白成(cheng)分(fen)。該(gai)技術(shu)也廣(guang)泛應(ying)用於(yu)檢測(ce)蛋白水(shui)平的表(biao)達。

二、分(fen)類5ⅹWestern Blot 膜(mo)封閉液(ye)）現(xian)常用的有(you)底(di)物化(hua)學發光ECL和(he)底(di)物DAB呈(cheng)色，體同(tong)水(shui)平和(he)實驗(yan)條件的是(shi)用*種方(fang)法，目(mu)前發(fa)表文章(zhang)通常是(shi)用底(di)物化(hua)學發光ECL。只(zhi)要買現(xian)成(cheng)的試(shi)劑(ji)盒就(jiu)行(xing)，操(cao)作也比(bi)較簡(jian)單，原理(li)如下（二抗(kang)用HRP標(biao)記）：反(fan)應底(di)物為(wei)過氧(yang)化物(wu)+魯(lu)米諾(nuo)，如(ru)遇到HRP，即發光，可(ke)使(shi)膠(jiao)片曝光，就(jiu)可(ke)洗出條帶(dai)。

三(san)、 主要試劑(ji)

、 丙烯酰胺(an)和(he)N，N’-亞甲雙(shuang)丙烯酰胺(an)，應以(yi)溫(wen)熱（以(yi)利(li)於溶解雙(shuang)丙稀酰胺(an)）的去(qu)離子(zi)水(shui)配(pei)制含(han)有29%（w/v）丙稀酰胺(an)和(he)%（w/v）N，N’-亞甲雙(shuang)丙烯酰胺(an)儲(chu)存液(ye)丙稀酰胺(an)29g，N，N-亞甲叉雙(shuang)丙稀酰胺(an)g，加(jia)H2O至 00ml。）儲(chu)於棕(zong)色(se)瓶，4℃避光保存。嚴(yan)格核實(shi)PH不得超過7.0，因可以(yi)發(fa)生脫(tuo)氨(an)基反(fan)應是(shi)光催化或堿催化的。使(shi)用期(qi)不(bu)得超過兩(liang)個(ge)月，隔幾個(ge)月須重(zhong)新(xin)配(pei)制。如(ru)有沈澱(dian)，可(ke)以(yi)過(guo)濾。2、 十二烷(wan)基硫(liu)#鈉SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離子(zi)水(shui)配(pei)制，室(shi)溫(wen)保存。

3、 分(fen)離膠緩沖液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混合，加(jia)水(shui)稀釋到(dao)00ml終體積。過濾(lv)後(hou)40℃保存。

4、 濃縮膠(jiao)緩沖液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於40mlH2O中，用約(yue)48ml mol/L HCl調至pH6.8加(jia)水(shui)稀釋到(dao)00ml終體積。過濾(lv)後(hou)40C保存。這(zhe)兩種緩沖液必(bi)須使(shi)用Tris堿制備，再(zai)用HCL調節(jie)PH值，而不用 Tris.CL。

5、 TEMED原溶(rong)液N，N，N’N’四甲基乙(yi)二胺(an)催化過(guo)硫(liu)#銨形成(cheng)自(zi)由基而加(jia)速(su)兩種丙稀酰胺(an)的聚(ju)合。PH太(tai)低時(shi)，聚(ju)合反(fan)應受到(dao)抑(yi)制。0%（w/v）過硫#胺(an)溶液。提(ti)供兩(liang)種丙稀酰胺(an)聚合所必(bi)須的自(zi)由基。去(qu)離子(zi)水(shui)配(pei)制數(shu)ml，臨用前配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加(jia)樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基乙(yi)醇(chun)3.2ml，0.05%溴酚藍(lan).6ml，H2O 32ml混勻(yun)備用。按(an):或:2比例(li)與蛋白質樣品混(hun)合，在沸(fei)水(shui)終煮3min混勻(yun)後(hou)再(zai)上(shang)樣，壹般(ban)為(wei)20-25ul，總蛋白量00μg。

7、 Tris-甘氨(an)#電泳緩沖液:30.3gTris，88g甘氨(an)#，0gSDS，用蒸(zheng)餾(liu)水(shui)溶解(jie)至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨(an)#電極緩沖液。臨(lin)用前稀釋0倍。

8、 轉移緩沖液：配(pei)制L轉移緩沖液，需稱(cheng)取(qu)2.9g甘氨(an)#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並(bing)加(jia)入(ru)200ml甲醇(chun)，加(jia)水(shui)至總量(liang)L。

9、 麗春紅染(ran)液(ye)儲(chu)存液(ye)：麗春紅S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺基水(shui)楊(yang)# 30g 加(jia)水(shui)至00ml 用時(shi)上(shang)述儲(chu)存液(ye)稀釋0倍即成(cheng)麗春紅S使(shi)用液(ye)。使(shi)用後(hou)應(ying)予以(yi)廢棄。

0、 脫(tuo)脂奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮(dan)鈉（有毒，戴(dai)手(shou)套(tao)操(cao)作），溶於磷(lin)#緩沖鹽溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖鹽溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗人-MMP-9（6）鼠抗人-TIMP-。

4、 過氧(yang)化物(wu)酶標(biao)記的第二抗(kang)體(ti)。

5、 NBT（溶於70%二甲基甲酰胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於00%二甲基甲酰胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。