【概要(yao)描述(shu)】0ⅹWestern Blot膜(mo)沖(chong)洗液 Western免疫(yi)印(yin)跡(Western Blot)是將(jiang)蛋白質(zhi)轉(zhuan)移到(dao)膜(mo)上(shang)，然(ran)後(hou)利(li)用(yong)抗體(ti)進行檢(jian)測。

0ⅹWestern Blot膜(mo)沖(chong)洗液 Western Blot技(ji)術(shu):

壹、 原理

與(yu)Southern或(huo)Northern雜(za)交(jiao)方(fang)法類似(si)，但Western Blot采(cai)用的(de)是聚丙烯(xi)酰胺(an)凝膠(jiao)電(dian)泳，被(bei)檢(jian)測物(wu)是蛋白質(zhi)，“探針(zhen)”是(shi)抗體(ti)，“顯(xian)色”用(yong)標記的(de)二抗。經(jing)過PAGE分(fen)離(li)的(de)蛋白質(zhi)樣品(pin)，轉移到(dao)固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)（例(li)如(ru)硝(xiao)#纖維素(su)薄(bo)膜(mo)）上(shang)，固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)以(yi)非共價(jia)鍵形式(shi)吸(xi)附(fu)蛋(dan)白質(zhi)，且能(neng)保(bao)持(chi)電(dian)泳分(fen)離(li)的(de)多(duo)肽類型及其(qi)生物學活(huo)性不(bu)變(bian)。以固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)上(shang)的(de)蛋白質(zhi)或(huo)多(duo)肽作為抗原，與對(dui)應(ying)的(de)抗體(ti)起免(mian)疫(yi)反應(ying)，再(zai)與酶或(huo)同(tong)位素(su)標記的(de)第(di)二(er)抗體(ti)起反應(ying)，經(jing)過底(di)物(wu)顯(xian)色或放(fang)射自(zi)顯(xian)影(ying)以(yi)檢(jian)測電(dian)泳分(fen)離(li)的(de)特異(yi)性目的(de)基因(yin)表(biao)達的(de)蛋白成分(fen)。該(gai)技(ji)術(shu)也(ye)廣(guang)泛應(ying)用於(yu)檢(jian)測蛋(dan)白水(shui)平的(de)表(biao)達。

二(er)、分(fen)類0ⅹWestern Blot膜(mo)沖(chong)洗液現常(chang)用(yong)的(de)有(you)底(di)物(wu)化(hua)學發光ECL和底(di)物(wu)DAB呈色，體同(tong)水(shui)平和實(shi)驗(yan)條(tiao)件(jian)的(de)是用(yong)*種方(fang)法，目前發(fa)表(biao)文(wen)章(zhang)通(tong)常(chang)是(shi)用(yong)底(di)物(wu)化(hua)學發光ECL。只(zhi)要買(mai)現(xian)成(cheng)的(de)試(shi)劑(ji)盒就行，操(cao)作也(ye)比(bi)較(jiao)簡單(dan)，原理如(ru)下（二(er)抗用(yong)HRP標記）：反應(ying)底物(wu)為過(guo)氧(yang)化(hua)物+魯(lu)米諾，如(ru)遇(yu)到(dao)HRP，即(ji)發(fa)光，可使膠片(pian)曝光(guang)，就(jiu)可洗出條(tiao)帶(dai)。

三(san)、 主要試(shi)劑(ji)

、 丙(bing)烯(xi)酰胺(an)和N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙烯(xi)酰胺(an)，應(ying)以溫(wen)熱（以(yi)利(li)於(yu)溶解雙丙(bing)稀(xi)酰胺(an)）的(de)去(qu)離(li)子(zi)水(shui)配制含有(you)29%（w/v）丙(bing)稀(xi)酰胺(an)和%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙烯(xi)酰胺(an)儲存(cun)液丙稀(xi)酰胺(an)29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉雙丙(bing)稀酰(xian)胺(an)g，加(jia)H2O至 00ml。）儲於(yu)棕色瓶，4℃避(bi)光(guang)保(bao)存。嚴(yan)格(ge)核(he)實(shi)PH不(bu)得超(chao)過(guo)7.0，因(yin)可以發(fa)生(sheng)脫氨(an)基反應(ying)是光(guang)催(cui)化(hua)或堿(jian)催(cui)化(hua)的(de)。使用期(qi)不(bu)得超(chao)過(guo)兩個月(yue)，隔幾個月(yue)須重新(xin)配制。如(ru)有(you)沈澱，可以過(guo)濾(lv)。 2、 十(shi)二(er)烷基硫(liu)#鈉(na)SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子(zi)水(shui)配制，室(shi)溫保(bao)存。

3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩沖(chong)液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混(hun)合(he)，加(jia)水(shui)稀釋到(dao)00ml終體積(ji)。過濾(lv)後40℃保(bao)存。

4、 濃縮膠(jiao)緩沖(chong)液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於(yu)40mlH2O中(zhong)，用(yong)約(yue)48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加(jia)水(shui)稀釋到(dao)00ml終體積(ji)。過濾(lv)後40C保(bao)存。這兩(liang)種緩(huan)沖(chong)液必(bi)須使用Tris堿(jian)制備(bei)，再(zai)用HCL調(tiao)節(jie)PH值，而不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四(si)甲(jia)基乙(yi)二(er)胺(an)催(cui)化(hua)過硫(liu)#銨形成(cheng)自(zi)由(you)基而(er)加(jia)速兩(liang)種丙(bing)稀(xi)酰胺(an)的(de)聚合(he)。PH太低(di)時，聚合(he)反應(ying)受到(dao)抑(yi)制。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺(an)溶液。提供(gong)兩(liang)種丙(bing)稀(xi)酰胺(an)聚合(he)所(suo)必(bi)須的(de)自由(you)基。去(qu)離(li)子(zi)水(shui)配制數(shu)ml，臨用(yong)前(qian)配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加(jia)樣緩沖(chong)液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖(chong)液8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基乙(yi)醇(chun)3.2ml，0.05%溴(xiu)酚藍(lan).6ml，H2O 32ml混(hun)勻備(bei)用。按(an):或(huo):2比(bi)例(li)與蛋白質(zhi)樣品(pin)混合(he)，在(zai)沸水(shui)終煮(zhu)3min混(hun)勻後(hou)再(zai)上樣，壹般(ban)為20-25ul，總(zong)蛋白量00μg。

7、 Tris-甘氨(an)#電(dian)泳緩沖(chong)液:30.3gTris，88g甘氨(an)#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)溶解至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨(an)#電(dian)極緩沖(chong)液。臨用(yong)前(qian)稀(xi)釋0倍(bei)。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩沖(chong)液：配制L轉(zhuan)移(yi)緩沖(chong)液，需稱(cheng)取(qu)2.9g甘氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加(jia)入(ru)200ml甲(jia)醇，加水(shui)至總(zong)量L。

9、 麗(li)春紅(hong)染液儲存(cun)液：麗春紅(hong)S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺(huang)基水(shui)楊# 30g 加(jia)水(shui)至00ml 用(yong)時上(shang)述(shu)儲存(cun)液稀釋0倍(bei)即(ji)成麗春紅(hong)S使用液。使用後(hou)應(ying)予以(yi)廢棄。

0、 脫脂奶(nai)粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉(na)（有(you)毒(du)，戴手(shou)套操(cao)作），溶於(yu)磷(lin)#緩(huan)沖(chong)鹽(yan)溶液（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖(chong)鹽(yan)溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗人(ren)-MMP-9（6）鼠抗人(ren)-TIMP-。

4、 過(guo)氧(yang)化(hua)物酶標記的(de)第(di)二(er)抗體(ti)。

5、 NBT（溶於(yu)70%二(er)甲(jia)基甲(jia)酰胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於(yu)00%二(er)甲(jia)基甲(jia)酰胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA