【概要(yao)描述】增強(qiang)型HRP-DAB底物顯色(se)試劑(ji)盒(he) Western免疫(yi)印跡(ji)(Western Blot)是(shi)將(jiang)蛋白質轉(zhuan)移(yi)到(dao)膜(mo)上(shang)，然(ran)後(hou)利用(yong)抗體(ti)進行(xing)檢測。

增強型HRP-DAB底物顯色(se)試劑(ji)盒(he)  Western Blot技(ji)術(shu): 做線(xian)粒體(ti)膜(mo)UCP2蛋白的Western Blot （以(yi)下(xia)簡寫(xie)成Western Blot），提取(qu)線(xian)粒體(ti)後(hou)凍存(cun)（未(wei)加(jia)蛋(dan)白酶(mei)抑制劑(ji)），樣(yang)品(pin)不(bu)能(neng)反(fan)復凍(dong)融(rong);，加(jia)蛋(dan)白酶(mei)抑制劑(ji)。同(tong)時，建(jian)議檢查Western Blot過程(cheng)， 提高(gao)壹抗濃度。對(dui)於加(jia)蛋(dan)白酶(mei)抑制劑(ji)來說，壹般加(jia)PMSF就可(ke)以(yi)了，能(neng)多(duo)加(jia)幾(ji)中(zhong)種(zhong)蛋白酶(mei)抑制劑(ji)。
同(tong)壹蛋白樣品(pin)能(neng)同(tong)時進行(xing)兩種(zhong)因子(zi)的(de)Western Blot檢測，有的甚至可以(yi)同(tong)時測幾(ji)十(shi)種(zhong)樣 增強(qiang)型HRP-DAB底物顯色(se)試劑(ji)盒(he) 如(ru)果是膜(mo)蛋白和(he)胞(bao)漿蛋白，所(suo)用(yong)的去垢劑(ji)就要(yao)溫和(he)得多，這時加(jia)上(shang)NaF去抑制磷#化酶(mei)的活(huo)性(xing)。
樣(yang)品(pin)的(de)蛋白含(han)量(liang)很低，每(mei)微(wei)升(sheng)不(bu)到(dao)微(wei)克，但(dan)是(shi)在(zai)轉(zhuan)膜(mo)時經常會(hui)發(fa)現(xian)只有(you)壹部(bu)分(fen)蛋(dan)白轉(zhuan)到(dao)了膜(mo)上(shang)，就是(shi)在(zai)轉(zhuan)膜(mo)後(hou)染膠(jiao)發(fa)現(xian)有的孔(kong)所(suo)有(you)的蛋白條帶都在(zai)，只是(shi)顏色變(bian)淡了，可(ke)以(yi)加(jia)大(da)上(shang)樣(yang)量(liang)，轉(zhuan)移(yi)時可以(yi)用減(jian)少(shao)電流(liu)延(yan)長(chang)時間，多加(jia)5-0%甲醇。
想(xiang)分(fen)離的(de)蛋(dan)白是分(fen)子(zi)量(liang)260kd的，SDS-PAGE電泳(yong)的(de)分(fen)離膠(jiao)濃(nong)度用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的(de)蛋(dan)白不好(hao)做(zuo)
如(ru)果上(shang)樣(yang)量(liang)超載，可以(yi)濃縮樣(yang)品，也可以(yi)根據妳(ni)的目標(biao)分(fen)子(zi)量(liang)透析(xi)掉壹部(bu)分(fen)小(xiao)分(fen)子(zi)蛋白。壹般地，超載30%是不會有問(wen)題的(de)。如(ru)果已(yi)經超了不(bu)少(shao)了，而且小(xiao)分(fen)子(zi)量(liang)的也要(yao)，可以(yi)考(kao)慮加(jia)大(da)膠的(de)厚(hou)度，可以(yi)試試.5mm的 comb。
蛋(dan)白變性(xing)後(hou)存放(fang)-80℃，壹兩年(nian)沒(mei)有問題，zui關鍵(jian)兩條(tiao)：不要(yao)被蛋(dan)白酶(mei)水解(jie)掉;不(bu)要(yao)被細(xi)菌消化掉（也是被酶(mei)水解(jie)了）。
采(cai)用(yong)DAB顯色(se)技(ji)術(shu)，二抗(kang)是(shi)化的(de)多(duo)克隆(long)抗體(ti)，三抗是(shi)親和(he)素(su)體(ti)系，不能(neng)使(shi)用(yong)脫(tuo)脂奶(nai)粉(fen)，脫(tuo)脂奶(nai)粉(fen)會影響(xiang)親和(he)素(su)的(de)生(sheng)成(cheng)，因為(wei)脫(tuo)脂奶(nai)粉(fen)中含(han)，用BSA代替應(ying)該(gai)好(hao)壹點 Western Blot壹般上(shang)樣(yang)30-00微(wei)克不(bu)等，結(jie)果跟(gen)目的(de)蛋白的豐(feng)度(du)、上(shang)樣(yang)量(liang)、壹二抗(kang)的(de)量(liang)和(he)撫(fu)育時間都有(you)關系(xi)，也與(yu)顯色(se)時間長(chang)短有(you)關。開(kai)始(shi)摸(mo)條(tiao)件時，為了拿(na)到(dao)陽(yang)性(xing)結(jie)果，各個(ge)步(bu)驟(zhou)都可以(yi)量(liang)多壹點時間長(chang)壹點，當(dang)然背景(jing)也就出(chu)來了。要(yao)拿到(dao)好的(de)結(jie)果，如(ru)果抗體(ti)好的話(hua)比較(jiao)容易，抗(kang)體(ti)不好的(de)話(hua)就需要(yao)反(fan)復地(di)試了，當(dang)然有(you)的(de)不(bu)適合(he)Western Blot的(de)怎(zen)樣(yang)做也不行(xing)。所(suo)以(yi)拿到(dao)好的(de)結(jie)果不容易。

  壹、 原理

與(yu)Southern或(huo)Northern雜(za)交方法類(lei)似，但(dan)Western Blot采用的(de)是(shi)聚丙(bing)烯(xi)酰胺(an)凝(ning)膠(jiao)電泳(yong)，被(bei)檢測物是蛋(dan)白質，“探針”是抗體(ti)，“顯色”用標記(ji)的(de)二抗(kang)。經(jing)過PAGE分(fen)離的(de)蛋(dan)白質樣(yang)品(pin)，轉(zhuan)移(yi)到(dao)固相(xiang)載體(ti)（例如(ru)硝(xiao)#纖維(wei)素(su)薄膜(mo)）上(shang)，固(gu)相(xiang)載體(ti)以(yi)非共價(jia)鍵(jian)形(xing)式吸(xi)附蛋(dan)白質，且(qie)能(neng)保持電泳(yong)分(fen)離的(de)多(duo)肽(tai)類(lei)型及其生(sheng)物學(xue)活(huo)性(xing)不(bu)變(bian)。以(yi)固相載體(ti)上(shang)的(de)蛋(dan)白質或(huo)多(duo)肽(tai)作(zuo)為(wei)抗(kang)原，與(yu)對(dui)應(ying)的(de)抗(kang)體(ti)起免疫(yi)反(fan)應(ying)，再與(yu)酶(mei)或(huo)同(tong)位素(su)標(biao)記(ji)的(de)第(di)二抗(kang)體(ti)起反(fan)應(ying)，經(jing)過底物顯色(se)或(huo)放(fang)射自顯(xian)影以(yi)檢測電泳(yong)分(fen)離的(de)特(te)異性(xing)目的(de)基因表達的(de)蛋(dan)白成分(fen)。該(gai)技(ji)術(shu)也廣泛(fan)應(ying)用(yong)於檢測蛋白水平(ping)的(de)表達。

二、分(fen)類(lei)  現常用的(de)有(you)底物化學(xue)發(fa)光(guang)ECL和(he)底物DAB呈(cheng)色(se)，體(ti)同(tong)水平(ping)和(he)實驗(yan)條(tiao)件的是(shi)用(yong)*種(zhong)方法，目前(qian)發(fa)表文(wen)章(zhang)通(tong)常是(shi)用底物化學(xue)發(fa)光(guang)ECL。只要(yao)買現成(cheng)的試劑(ji)盒(he)就行(xing)，操(cao)作也比較(jiao)簡單，原理如(ru)下(xia)（二抗(kang)用(yong)HRP標記(ji)）：反(fan)應(ying)底物為過氧(yang)化物+魯(lu)米(mi)諾，如(ru)遇(yu)到(dao)HRP，即發(fa)光(guang)，可使膠片(pian)曝(pu)光(guang)，就可(ke)洗(xi)出條(tiao)帶。

三、 主要(yao)試劑(ji)

、 丙(bing)烯(xi)酰胺(an)和(he)N，N’-亞甲雙丙(bing)烯(xi)酰胺(an)，應(ying)以(yi)溫熱(re)（以(yi)利於溶解(jie)雙丙(bing)稀(xi)酰胺(an)）的去離子(zi)水配制含(han)有29%（w/v）丙(bing)稀(xi)酰胺(an)和(he)%（w/v）N，N’-亞甲雙丙(bing)烯(xi)酰胺(an)儲(chu)存(cun)液(ye)丙(bing)稀(xi)酰胺(an)29g，N，N-亞甲叉雙丙(bing)稀(xi)酰胺(an)g，加(jia)H2O至 00ml。）儲於棕(zong)色(se)瓶(ping)，4℃避光保存。嚴格核(he)實PH不得超過7.0，因可(ke)以(yi)發(fa)生(sheng)脫(tuo)氨(an)基(ji)反(fan)應(ying)是(shi)光(guang)催(cui)化或(huo)堿(jian)催(cui)化的(de)。使(shi)用期(qi)不(bu)得超過兩個(ge)月(yue)，隔(ge)幾(ji)個(ge)月(yue)須(xu)重新配制。如(ru)有(you)沈澱(dian)，可以(yi)過濾。  2、 十(shi)二烷(wan)基(ji)硫(liu)#鈉(na)SDS溶液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離子(zi)水配制，室溫保存。

3、 分(fen)離膠(jiao)緩沖(chong)液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混合(he)，加(jia)水稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終體(ti)積(ji)。過濾後(hou)40℃保存。

4、 濃縮膠(jiao)緩沖(chong)液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於40mlH2O中，用約(yue)48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加(jia)水稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終體(ti)積(ji)。過濾後(hou)40C保存。這兩種(zhong)緩沖(chong)液(ye)必(bi)須(xu)使用(yong)Tris堿制備(bei)，再用(yong)HCL調(tiao)節PH值，而不用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原溶液(ye)N，N，N’N’四(si)甲基乙(yi)二胺(an)催(cui)化過硫(liu)#銨形(xing)成(cheng)自(zi)由基而加(jia)速(su)兩種(zhong)丙(bing)稀(xi)酰胺(an)的(de)聚(ju)合(he)。PH太低時，聚合(he)反(fan)應(ying)受(shou)到(dao)抑制。0%（w/v）過硫(liu)#胺(an)溶液(ye)。提供(gong)兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀(xi)酰胺(an)聚(ju)合(he)所(suo)必(bi)須(xu)的自(zi)由基。去離子(zi)水配制數(shu)ml，臨用(yong)前(qian)配制.

6、 SDS- PAGE加(jia)樣(yang)緩沖(chong)液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖(chong)液(ye)8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍.6ml，H2O 32ml混勻(yun)備(bei)用(yong)。按:或(huo):2比例(li)與(yu)蛋白質樣(yang)品(pin)混合(he)，在(zai)沸(fei)水終煮3min混勻(yun)後(hou)再上(shang)樣(yang)，壹般為20-25ul，總蛋(dan)白量(liang)00μg。

7、 Tris-甘氨#電泳(yong)緩沖(chong)液(ye):30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用蒸(zheng)餾(liu)水溶解(jie)至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極(ji)緩沖(chong)液(ye)。臨用(yong)前(qian)稀釋(shi)0倍。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩沖(chong)液(ye)：配制L轉(zhuan)移(yi)緩沖(chong)液(ye)，需稱取(qu)2.9g甘氨#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並加(jia)入200ml甲醇，加(jia)水至總量(liang)L。

9、 麗春紅染液(ye)儲(chu)存液：麗春紅S 2g 三#乙#30g 磺基水楊(yang)# 30g 加(jia)水至00ml 用時上(shang)述儲存(cun)液稀(xi)釋(shi)0倍即成(cheng)麗(li)春紅S使用液(ye)。使(shi)用後(hou)應(ying)予(yu)以(yi)廢棄。

0、 脫(tuo)脂奶(nai)粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉(na)（有毒，戴手套(tao)操(cao)作），溶於磷#緩沖(chong)鹽(yan)溶液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖(chong)鹽(yan)溶液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗人(ren)-MMP-9（6）鼠抗人(ren)-TIMP-。

4、 過氧(yang)化物酶(mei)標記(ji)的(de)第(di)二抗(kang)體(ti)。

5、 NBT（溶於70%二甲基甲酰胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於00%二甲基甲酰胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。