【概要(yao)描(miao)述】TMB底(di)物顯色(se)試(shi)劑盒免疫印(yin)跡(Western Blot)是將蛋(dan)白質轉(zhuan)移到膜(mo)上(shang)，然後利(li)用抗體進(jin)行檢(jian)測(ce)。

TMB底(di)物顯色(se)試(shi)劑盒 Western Blot技(ji)術(shu):

壹(yi)、 原(yuan)理

與(yu)Southern或(huo)Northern雜(za)交方(fang)法類似，但(dan)Western Blot采(cai)用(yong)的(de)是聚(ju)丙烯酰胺凝膠電泳，被檢(jian)測(ce)物是蛋(dan)白質，“探(tan)針”是(shi)抗體，“顯色(se)”用(yong)標(biao)記(ji)的(de)二(er)抗。經(jing)過PAGE分離的(de)蛋(dan)白質樣品(pin)，轉(zhuan)移到固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)（例如硝(xiao)#纖維(wei)素薄(bo)膜(mo)）上(shang)，固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)以(yi)非共(gong)價(jia)鍵形(xing)式(shi)吸(xi)附(fu)蛋(dan)白質，且能(neng)保(bao)持電泳分離的(de)多肽(tai)類型及(ji)其(qi)生(sheng)物學(xue)活性不變。以(yi)固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)上(shang)的(de)蛋(dan)白質或(huo)多肽(tai)作為抗原，與(yu)對(dui)應(ying)的(de)抗體起(qi)免疫反(fan)應(ying)，再(zai)與(yu)酶或(huo)同(tong)位素標(biao)記(ji)的(de)第二(er)抗體起(qi)反(fan)應(ying)，經(jing)過底(di)物顯色(se)或(huo)放射(she)自(zi)顯影(ying)以(yi)檢測(ce)電泳分離的(de)特(te)異性目(mu)的(de)基因(yin)表(biao)達的(de)蛋(dan)白成分。該(gai)技術(shu)也廣(guang)泛應(ying)用(yong)於檢(jian)測(ce)蛋(dan)白水平的(de)表達。

二(er)、分類TMB底(di)物顯色(se)試(shi)劑盒  現(xian)常用(yong)的(de)有底(di)物化(hua)學(xue)發光ECL和底(di)物DAB呈(cheng)色(se)，體同(tong)水平和實(shi)驗(yan)條件的(de)是用(yong)*種(zhong)方(fang)法，目(mu)前(qian)發表(biao)文章(zhang)通常是(shi)用(yong)底(di)物化(hua)學(xue)發光ECL。只要(yao)買(mai)現(xian)成的(de)試(shi)劑盒就(jiu)行，操作(zuo)也比(bi)較(jiao)簡(jian)單(dan)，原(yuan)理如(ru)下(xia)（二(er)抗用HRP標(biao)記(ji)）：反(fan)應(ying)底(di)物為(wei)過氧化(hua)物(wu)+魯(lu)米諾(nuo)，如(ru)遇到HRP，即(ji)發光(guang)，可使(shi)膠片(pian)曝(pu)光，就(jiu)可洗(xi)出條帶(dai)。

三(san)、 主要(yao)試(shi)劑

、 丙烯酰胺和N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙烯酰胺，應(ying)以(yi)溫(wen)熱（以(yi)利(li)於溶解雙(shuang)丙稀(xi)酰胺）的(de)去離(li)子水配(pei)制含有(you)29%（w/v）丙稀(xi)酰胺和%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙烯酰胺儲(chu)存液(ye)丙稀(xi)酰胺29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉(cha)雙丙稀(xi)酰胺g，加(jia)H2O至(zhi) 00ml。）儲(chu)於棕色(se)瓶，4℃避(bi)光保(bao)存。嚴格核(he)實PH不(bu)得超(chao)過7.0，因(yin)可以(yi)發生(sheng)脫氨(an)基反(fan)應(ying)是(shi)光(guang)催(cui)化或(huo)堿催(cui)化的(de)。使用(yong)期(qi)不得超(chao)過兩(liang)個月(yue)，隔幾(ji)個月須重新(xin)配(pei)制。如有(you)沈澱，可以(yi)過濾(lv)。 2、 十二(er)烷基硫(liu)#鈉SDS溶液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離(li)子水配(pei)制，室溫(wen)保(bao)存。

3、 分離膠緩(huan)沖液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合(he)，加水稀(xi)釋(shi)到00ml終體(ti)積(ji)。過濾(lv)後40℃保(bao)存。

4、 濃(nong)縮(suo)膠緩(huan)沖液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於40mlH2O中(zhong)，用(yong)約48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加(jia)水稀(xi)釋(shi)到00ml終體(ti)積(ji)。過濾(lv)後40C保(bao)存。這兩(liang)種緩(huan)沖液(ye)必(bi)須(xu)使用Tris堿(jian)制備，再(zai)用HCL調(tiao)節PH值(zhi)，而不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶液(ye)N，N，N’N’四甲基乙(yi)二(er)胺催(cui)化過硫(liu)#銨(an)形(xing)成(cheng)自(zi)由基而加(jia)速(su)兩(liang)種丙稀(xi)酰胺的(de)聚(ju)合(he)。PH太(tai)低(di)時，聚(ju)合(he)反(fan)應(ying)受(shou)到抑制。0%（w/v）過硫(liu)#胺(an)溶液(ye)。提供兩(liang)種丙稀(xi)酰胺聚(ju)合(he)所(suo)必(bi)須(xu)的(de)自由(you)基(ji)。去離(li)子水配(pei)制數(shu)ml，臨(lin)用(yong)前(qian)配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加(jia)樣(yang)緩(huan)沖液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖液(ye)8ml，甘(gan)油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基(ji)乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚藍(lan).6ml，H2O 32ml混勻(yun)備(bei)用(yong)。按(an):或(huo):2比(bi)例與(yu)蛋(dan)白質樣品(pin)混合(he)，在(zai)沸(fei)水終煮(zhu)3min混勻(yun)後再上(shang)樣(yang)，壹(yi)般(ban)為(wei)20-25ul，總蛋(dan)白量00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨(an)#電泳緩(huan)沖液(ye):30.3gTris，88g甘(gan)氨(an)#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水溶解至(zhi)000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨(an)#電極(ji)緩(huan)沖液(ye)。臨(lin)用(yong)前(qian)稀(xi)釋(shi)0倍。

8、 轉(zhuan)移緩(huan)沖液(ye)：配(pei)制L轉(zhuan)移緩(huan)沖液(ye)，需(xu)稱取(qu)2.9g甘(gan)氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加(jia)入200ml甲(jia)醇，加(jia)水至總量(liang)L。

9、 麗春(chun)紅(hong)染(ran)液(ye)儲(chu)存液(ye)：麗春(chun)紅(hong)S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺基(ji)水楊(yang)# 30g 加(jia)水至00ml 用(yong)時上(shang)述儲(chu)存液(ye)稀(xi)釋(shi)0倍即(ji)成麗春(chun)紅(hong)S使(shi)用(yong)液(ye)。使(shi)用(yong)後應(ying)予(yu)以(yi)廢棄。

0、 脫脂(zhi)奶粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮(dan)鈉（有(you)毒(du)，戴手(shou)套操作(zuo)），溶於磷(lin)#緩(huan)沖鹽(yan)溶液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖鹽(yan)溶液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗人-MMP-9（6）鼠(shu)抗人-TIMP-。

4、 過氧化(hua)物(wu)酶標(biao)記(ji)的(de)第二(er)抗體。

5、 NBT（溶於70%二(er)甲基(ji)甲酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於00%二(er)甲基(ji)甲酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L  做(zuo)線(xian)粒(li)體膜(mo)UCP2蛋(dan)白的(de)Western Blot （以(yi)下(xia)簡(jian)寫(xie)成Western Blot），提取(qu)線(xian)粒(li)體後凍存（未(wei)加蛋(dan)白酶抑制劑），樣(yang)品不(bu)能(neng)反(fan)復凍融;，加(jia)蛋(dan)白酶抑制劑。同(tong)時，建(jian)議檢(jian)查(zha)Western Blot過程， 提高(gao)壹(yi)抗濃度。對於加(jia)蛋(dan)白酶抑制劑來(lai)說(shuo)，壹(yi)般(ban)加(jia)PMSF就(jiu)可以(yi)了(le)，能(neng)多加(jia)幾(ji)中種(zhong)蛋(dan)白酶抑制劑。
同(tong)壹(yi)蛋(dan)白樣品(pin)能同(tong)時進(jin)行兩(liang)種因(yin)子的(de)Western Blot檢測(ce)，有的(de)甚至(zhi)可以(yi)同(tong)時測(ce)幾十種樣(yang)品(pin)。
如(ru)果是膜(mo)蛋(dan)白和胞漿蛋(dan)白，所(suo)用(yong)的(de)去垢劑就(jiu)要(yao)溫(wen)和得多，這時加上(shang)NaF去抑制磷(lin)#化酶的(de)活性。
樣品(pin)的(de)蛋(dan)白含量(liang)很低，每(mei)微(wei)升(sheng)不(bu)到微(wei)克(ke)，但(dan)是在(zai)轉(zhuan)膜(mo)時經(jing)常會發(fa)現(xian)只有壹(yi)部(bu)分蛋(dan)白轉(zhuan)到了(le)膜(mo)上(shang)，就(jiu)是在(zai)轉(zhuan)膜(mo)後染(ran)膠發(fa)現(xian)有的(de)孔所(suo)有(you)的(de)蛋(dan)白條帶(dai)都在(zai)，只是顏色(se)變淡(dan)了(le)，可以(yi)加大(da)上(shang)樣(yang)量(liang)，轉(zhuan)移時可以(yi)用減(jian)少(shao)電流延(yan)長(chang)時間，多加(jia)5-0%甲(jia)醇。
想(xiang)分離的(de)蛋(dan)白是分子量(liang)260kd的(de)，SDS-PAGE電泳的(de)分離膠濃(nong)度用6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的(de)蛋(dan)白不好做(zuo)
如果上(shang)樣(yang)量(liang)超(chao)載(zai)，可以(yi)濃縮(suo)樣(yang)品，也(ye)可以(yi)根據(ju)妳(ni)的(de)目(mu)標(biao)分子量(liang)透析掉壹(yi)部(bu)分小(xiao)分子蛋(dan)白。壹(yi)般(ban)地，超(chao)載(zai)30%是(shi)不(bu)會有(you)問題的(de)。如果已(yi)經(jing)超(chao)了(le)不(bu)少了(le)，而且小(xiao)分子量(liang)的(de)也要(yao)，可以(yi)考慮(lv)加(jia)大膠的(de)厚度，可以(yi)試(shi)試(shi).5mm的(de) comb。
蛋(dan)白變性後存放-80℃，壹(yi)兩(liang)年沒有問(wen)題，zui關(guan)鍵(jian)兩(liang)條：不(bu)要(yao)被蛋(dan)白酶水解掉(diao);不(bu)要(yao)被細(xi)菌消化掉(diao)（也(ye)是被酶水解了(le)）。
采(cai)用DAB顯色(se)技術(shu)，二(er)抗是化的(de)多克(ke)隆抗體，三(san)抗是親和素(su)體(ti)系，不能使用(yong)脫脂(zhi)奶粉(fen)，脫脂(zhi)奶粉(fen)會影(ying)響親和素(su)的(de)生(sheng)成，因(yin)為(wei)脫脂(zhi)奶粉(fen)中含，用BSA代替應(ying)該(gai)好壹(yi)點(dian).
Western Blot壹(yi)般(ban)上(shang)樣(yang)30-00微(wei)克(ke)不(bu)等(deng)，結果跟目(mu)的(de)蛋(dan)白的(de)豐度、上(shang)樣(yang)量(liang)、壹(yi)二(er)抗的(de)量和撫育時間都有關(guan)系，也與(yu)顯色(se)時間長短(duan)有(you)關(guan)。開(kai)始(shi)摸條件時，為了(le)拿到陽(yang)性結果，各個(ge)步(bu)驟都(dou)可以(yi)量多壹(yi)點(dian)時間長壹(yi)點(dian)，當(dang)然背(bei)景也(ye)就(jiu)出來了(le)。要(yao)拿到好的(de)結果，如果抗體好的(de)話(hua)比(bi)較容易(yi)，抗體不好的(de)話(hua)就(jiu)需要(yao)反(fan)復地試(shi)了(le)，當(dang)然有的(de)不適合(he)Western Blot的(de)怎(zen)樣做也不(bu)行。所(suo)以(yi)拿到好的(de)結果不容(rong)易。