【概要(yao)描述】PVDF膜 Western免疫(yi)印跡(Western Blot)是將蛋白(bai)質轉(zhuan)移到(dao)膜上，然(ran)後(hou)利用抗體進行(xing)檢(jian)測。

PVDF膜 Western Blot技(ji)術: 做(zuo)線粒(li)體(ti)膜UCP2蛋白(bai)的(de)Western Blot （以(yi)下(xia)簡(jian)寫(xie)成(cheng)Western Blot），提取(qu)線(xian)粒(li)體(ti)後(hou)凍存(cun)（未(wei)加蛋白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑），樣品(pin)不(bu)能反復(fu)凍融(rong);，加蛋白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑。同(tong)時(shi)，建(jian)議(yi)檢(jian)查Western Blot過(guo)程(cheng)， 提高壹抗濃度。對(dui)於(yu)加蛋白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑來說，壹(yi)般加PMSF就(jiu)可以(yi)了，能(neng)多加幾中(zhong)種(zhong)蛋白(bai)酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑。
同(tong)壹(yi)蛋(dan)白(bai)樣品(pin)能(neng)同(tong)時(shi)進行(xing)兩種(zhong)因子的(de)Western Blot檢(jian)測，有(you)的(de)甚(shen)至可(ke)以(yi)同(tong)時(shi)測幾(ji)十(shi)種(zhong)樣PVDF膜 如(ru)果是膜蛋白(bai)和胞(bao)漿(jiang)蛋(dan)白(bai)，所用的(de)去垢(gou)劑(ji)就(jiu)要(yao)溫(wen)和(he)得多，這時加上NaF去抑制(zhi)磷(lin)#化酶的(de)活性。
樣品(pin)的(de)蛋(dan)白(bai)含量很低(di)，每微升不到(dao)微克(ke)，但(dan)是(shi)在(zai)轉(zhuan)膜時經(jing)常(chang)會(hui)發現只(zhi)有壹(yi)部分(fen)蛋(dan)白(bai)轉(zhuan)到了(le)膜上，就(jiu)是在(zai)轉(zhuan)膜後(hou)染膠發現有的(de)孔所有(you)的(de)蛋(dan)白(bai)條(tiao)帶都(dou)在(zai)，只(zhi)是顏(yan)色變淡了，可以加大(da)上樣(yang)量(liang)，轉(zhuan)移時(shi)可(ke)以用減(jian)少(shao)電流(liu)延長時間，多加5-0%甲醇(chun)。
想(xiang)分(fen)離(li)的(de)蛋(dan)白(bai)是分子量(liang)260kd的(de)，SDS-PAGE電(dian)泳的(de)分(fen)離(li)膠(jiao)濃度用6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的(de)蛋(dan)白(bai)不好做(zuo)
如(ru)果上樣量超載，可(ke)以(yi)濃縮樣品(pin)，也(ye)可以(yi)根據(ju)妳(ni)的(de)目標(biao)分子量(liang)透(tou)析掉(diao)壹(yi)部分(fen)小(xiao)分(fen)子蛋(dan)白。壹(yi)般地，超載30%是(shi)不(bu)會(hui)有問題的(de)。如(ru)果已經超了不(bu)少(shao)了(le)，而且小(xiao)分子量(liang)的(de)也(ye)要(yao)，可以(yi)考(kao)慮(lv)加大(da)膠的(de)厚(hou)度，可以試試.5mm的(de) comb。
蛋(dan)白(bai)變性後(hou)存(cun)放(fang)-80℃，壹兩年沒有問題，zui關鍵兩條(tiao)：不(bu)要(yao)被蛋(dan)白酶水(shui)解掉(diao);不(bu)要(yao)被細(xi)菌(jun)消(xiao)化掉（也是(shi)被(bei)酶(mei)水(shui)解了(le)）。
采(cai)用DAB顯(xian)色技(ji)術，二(er)抗是化的(de)多克(ke)隆(long)抗體，三抗是親(qin)和(he)素(su)體(ti)系(xi)，不(bu)能(neng)使(shi)用脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉，脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉會(hui)影(ying)響親(qin)和素的(de)生(sheng)成(cheng)，因為(wei)脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉中(zhong)含，用BSA代(dai)替應該好壹點 Western Blot壹般上樣(yang)30-00微克(ke)不(bu)等(deng)，結果跟目的(de)蛋(dan)白(bai)的(de)豐度、上(shang)樣(yang)量、壹二(er)抗的(de)量(liang)和(he)撫育(yu)時(shi)間都(dou)有(you)關系(xi)，也(ye)與(yu)顯(xian)色時(shi)間(jian)長(chang)短有關。開始(shi)摸條(tiao)件(jian)時，為(wei)了(le)拿(na)到(dao)陽(yang)性結果，各個步驟都可(ke)以(yi)量多壹點時間長壹(yi)點，當然背(bei)景也就(jiu)出來了。要(yao)拿(na)到(dao)好的(de)結果，如(ru)果抗體好的(de)話(hua)比較容易，抗體不(bu)好的(de)話(hua)就(jiu)需(xu)要(yao)反復(fu)地試了，當然有(you)的(de)不(bu)適(shi)合(he)Western Blot的(de)怎樣(yang)做(zuo)也不行(xing)。所以拿(na)到(dao)好的(de)結果不容易。

 壹(yi)、 原(yuan)理(li)

與(yu)Southern或(huo)Northern雜(za)交(jiao)方(fang)法(fa)類(lei)似(si)，但(dan)Western Blot采(cai)用的(de)是(shi)聚丙烯酰胺凝(ning)膠電泳，被檢(jian)測物是蛋(dan)白(bai)質，“探(tan)針(zhen)”是(shi)抗體，“顯(xian)色”用標(biao)記的(de)二(er)抗。經過(guo)PAGE分(fen)離(li)的(de)蛋(dan)白(bai)質樣(yang)品(pin)，轉(zhuan)移到(dao)固(gu)相載(zai)體(ti)（例如(ru)硝(xiao)#纖(xian)維(wei)素(su)薄(bo)膜）上(shang)，固(gu)相載(zai)體(ti)以非(fei)共(gong)價鍵(jian)形式(shi)吸附蛋(dan)白(bai)質，且能(neng)保持電(dian)泳分離(li)的(de)多肽類(lei)型(xing)及其(qi)生物學活性不變。以固(gu)相載(zai)體(ti)上的(de)蛋(dan)白(bai)質或(huo)多肽作(zuo)為(wei)抗原(yuan)，與(yu)對(dui)應的(de)抗體起(qi)免(mian)疫(yi)反應，再與酶(mei)或(huo)同(tong)位(wei)素(su)標(biao)記的(de)第(di)二(er)抗體起(qi)反應，經過(guo)底(di)物顯(xian)色或(huo)放(fang)射(she)自(zi)顯(xian)影(ying)以檢(jian)測電(dian)泳分離(li)的(de)特異(yi)性目的(de)基(ji)因表(biao)達(da)的(de)蛋(dan)白(bai)成(cheng)分(fen)。該(gai)技(ji)術也(ye)廣泛(fan)應用於(yu)檢(jian)測蛋(dan)白(bai)水(shui)平的(de)表(biao)達(da)。

二(er)、分類(lei)  現常(chang)用的(de)有(you)底(di)物化學發光(guang)ECL和(he)底(di)物DAB呈(cheng)色，體(ti)同(tong)水(shui)平和(he)實(shi)驗條(tiao)件(jian)的(de)是(shi)用*種(zhong)方(fang)法(fa)，目前發(fa)表(biao)文章通(tong)常(chang)是(shi)用底(di)物化學發光(guang)ECL。只(zhi)要(yao)買(mai)現成(cheng)的(de)試劑盒就(jiu)行(xing)，操作也比較簡(jian)單，原(yuan)理(li)如(ru)下(xia)（二(er)抗用HRP標(biao)記）：反應底(di)物為(wei)過(guo)氧(yang)化物+魯(lu)米諾(nuo)，如(ru)遇(yu)到HRP，即發(fa)光，可使膠(jiao)片曝(pu)光，就(jiu)可洗(xi)出條(tiao)帶。

三、 主要(yao)試劑

、 丙(bing)烯酰胺和(he)N，N’-亞(ya)甲雙(shuang)丙(bing)烯酰胺，應以溫(wen)熱(re)（以(yi)利(li)於(yu)溶解雙(shuang)丙(bing)稀酰(xian)胺）的(de)去離(li)子水(shui)配(pei)制(zhi)含有29%（w/v）丙(bing)稀酰(xian)胺和(he)%（w/v）N，N’-亞(ya)甲雙(shuang)丙(bing)烯酰胺儲存(cun)液(ye)丙稀酰(xian)胺29g，N，N-亞(ya)甲叉雙(shuang)丙(bing)稀酰(xian)胺g，加H2O至 00ml。）儲於(yu)棕(zong)色瓶(ping)，4℃避(bi)光保存(cun)。嚴(yan)格核實(shi)PH不(bu)得(de)超過(guo)7.0，因可以(yi)發生(sheng)脫(tuo)氨(an)基(ji)反應是光催(cui)化或堿催(cui)化的(de)。使(shi)用期不(bu)得(de)超過(guo)兩(liang)個月，隔幾個月須(xu)重(zhong)新(xin)配(pei)制(zhi)。如(ru)有(you)沈澱，可(ke)以(yi)過(guo)濾。  2、 十(shi)二(er)烷(wan)基(ji)硫#鈉SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離(li)子水(shui)配(pei)制(zhi)，室溫(wen)保存(cun)。

3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩(huan)沖(chong)液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混(hun)合(he)，加水(shui)稀釋到00ml終(zhong)體(ti)積。過(guo)濾後(hou)40℃保存(cun)。

4、 濃縮膠緩(huan)沖(chong)液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於(yu)40mlH2O中(zhong)，用約(yue)48ml mol/L HCl調至pH6.8加水(shui)稀釋到00ml終(zhong)體(ti)積。過(guo)濾後(hou)40C保存(cun)。這(zhe)兩種(zhong)緩(huan)沖(chong)液必須(xu)使(shi)用Tris堿(jian)制(zhi)備，再用HCL調節(jie)PH值，而不(bu)用 Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液(ye)N，N，N’N’四(si)甲基(ji)乙(yi)二(er)胺催(cui)化過(guo)硫#銨形(xing)成(cheng)自(zi)由(you)基(ji)而加速(su)兩種(zhong)丙稀酰(xian)胺的(de)聚合。PH太(tai)低(di)時(shi)，聚合反應受(shou)到抑制(zhi)。0%（w/v）過(guo)硫#胺(an)溶(rong)液(ye)。提供兩種(zhong)丙稀酰(xian)胺聚合所(suo)必須(xu)的(de)自(zi)由(you)基(ji)。去離(li)子水(shui)配(pei)制(zhi)數ml，臨用前配(pei)制(zhi).

6、 SDS- PAGE加樣緩(huan)沖(chong)液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖(chong)液8ml，甘油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙(yi)醇(chun)3.2ml，0.05%溴酚藍(lan).6ml，H2O 32ml混(hun)勻(yun)備用。按:或(huo):2比例與蛋(dan)白質樣(yang)品(pin)混(hun)合(he)，在(zai)沸水(shui)終煮(zhu)3min混(hun)勻(yun)後(hou)再上(shang)樣(yang)，壹般(ban)為(wei)20-25ul，總(zong)蛋(dan)白(bai)量00μg。

7、 Tris-甘氨(an)#電(dian)泳緩(huan)沖(chong)液:30.3gTris，88g甘氨(an)#，0gSDS，用蒸(zheng)餾(liu)水(shui)溶解至000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨(an)#電(dian)極緩(huan)沖(chong)液。臨用前稀釋0倍(bei)。

8、 轉(zhuan)移緩(huan)沖(chong)液：配(pei)制(zhi)L轉(zhuan)移緩(huan)沖(chong)液，需(xu)稱取(qu)2.9g甘氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入(ru)200ml甲醇(chun)，加水(shui)至總(zong)量(liang)L。

9、 麗(li)春(chun)紅(hong)染液儲存(cun)液(ye)：麗(li)春(chun)紅(hong)S 2g 三#乙(yi)#30g 磺(huang)基(ji)水(shui)楊# 30g 加水(shui)至00ml 用時(shi)上(shang)述儲存(cun)液(ye)稀釋0倍(bei)即成(cheng)麗(li)春(chun)紅(hong)S使(shi)用液(ye)。使(shi)用後(hou)應予以(yi)廢(fei)棄。

0、 脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮鈉（有(you)毒(du)，戴手套(tao)操(cao)作），溶(rong)於(yu)磷(lin)#緩(huan)沖(chong)鹽溶液（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖(chong)鹽溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗人-MMP-9（6）鼠(shu)抗人-TIMP-。

4、 過(guo)氧(yang)化物酶標(biao)記的(de)第(di)二(er)抗體。

5、 NBT（溶(rong)於(yu)70%二(er)甲基(ji)甲酰(xian)胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於(yu)00%二(er)甲基(ji)甲酰(xian)胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。