【概(gai)要描述】硝(xiao)酸纖(xian)維(wei)素膜(mo)（NC） Western Blot)是(shi)將蛋白質轉移(yi)到(dao)膜(mo)上，然後(hou)利(li)用抗體(ti)進(jin)行檢(jian)測(ce)。

硝酸(suan)纖(xian)維(wei)素膜(mo)（NC）
  Western Blot技(ji)術(shu):

壹(yi)、 原(yuan)理(li)

與Southern或(huo)Northern雜(za)交方法(fa)類(lei)似(si)，但Western Blot采用的(de)是聚丙烯(xi)酰(xian)胺(an)凝(ning)膠電泳(yong)，被(bei)檢測(ce)物(wu)是蛋(dan)白質，“探針”是(shi)抗(kang)體(ti)，“顯色”用標(biao)記(ji)的(de)二抗(kang)。經(jing)過PAGE分(fen)離的(de)蛋白質樣品，轉移(yi)到(dao)固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)（例(li)如(ru)硝(xiao)#纖維(wei)素薄膜）上，固相(xiang)載體(ti)以(yi)非(fei)共(gong)價鍵形式(shi)吸附(fu)蛋白質，且(qie)能保(bao)持(chi)電泳(yong)分(fen)離的(de)多(duo)肽(tai)類型及其生物(wu)學活性不(bu)變(bian)。以(yi)固相載(zai)體(ti)上的(de)蛋白質或(huo)多(duo)肽(tai)作(zuo)為(wei)抗(kang)原(yuan)，與(yu)對應(ying)的(de)抗體(ti)起(qi)免疫(yi)反應(ying)，再與(yu)酶或同(tong)位(wei)素標(biao)記(ji)的(de)第二(er)抗體(ti)起反應(ying)，經(jing)過底(di)物(wu)顯色或放射自(zi)顯(xian)影以(yi)檢測電泳(yong)分(fen)離的(de)特(te)異(yi)性目(mu)的(de)基因(yin)表達(da)的(de)蛋白成(cheng)分(fen)。該技(ji)術(shu)也(ye)廣(guang)泛應(ying)用於檢測(ce)蛋(dan)白水平(ping)的(de)表達(da)。

二(er)、分(fen)類硝(xiao)酸纖(xian)維素膜(mo)（NC）
現(xian)常用的(de)有(you)底(di)物(wu)化(hua)學(xue)發光ECL和底(di)物(wu)DAB呈色，體同(tong)水平(ping)和(he)實驗(yan)條(tiao)件(jian)的(de)是用*種方法(fa)，目(mu)前發表文章通常(chang)是用底(di)物(wu)化(hua)學(xue)發光ECL。只要(yao)買(mai)現(xian)成(cheng)的(de)試(shi)劑(ji)盒(he)就(jiu)行，操(cao)作(zuo)也(ye)比較簡(jian)單，原(yuan)理(li)如(ru)下(xia)（二抗(kang)用HRP標(biao)記(ji)）：反應(ying)底(di)物(wu)為(wei)過(guo)氧化(hua)物(wu)+魯(lu)米諾，如(ru)遇(yu)到(dao)HRP，即(ji)發光，可使膠片曝光，就(jiu)可洗(xi)出條(tiao)帶。

三(san)、 主(zhu)要(yao)試(shi)劑(ji)

、 丙烯(xi)酰(xian)胺(an)和(he)N，N’-亞(ya)甲雙(shuang)丙烯(xi)酰(xian)胺(an)，應(ying)以(yi)溫熱(re)（以(yi)利(li)於溶解(jie)雙(shuang)丙稀(xi)酰胺(an)）的(de)去離子水配制含(han)有(you)29%（w/v）丙稀(xi)酰胺(an)和%（w/v）N，N’-亞(ya)甲雙(shuang)丙烯(xi)酰(xian)胺(an)儲(chu)存(cun)液(ye)丙稀(xi)酰胺(an)29g，N，N-亞(ya)甲叉雙(shuang)丙稀(xi)酰胺(an)g，加H2O至 00ml。）儲(chu)於棕(zong)色瓶，4℃避光保(bao)存(cun)。嚴(yan)格(ge)核(he)實PH不(bu)得超(chao)過(guo)7.0，因(yin)可以(yi)發生脫氨(an)基(ji)反應(ying)是光催化(hua)或(huo)堿(jian)催化(hua)的(de)。使用期(qi)不(bu)得超(chao)過(guo)兩個月，隔(ge)幾(ji)個月須重(zhong)新配(pei)制(zhi)。如(ru)有(you)沈澱(dian)，可以(yi)過濾。
2、 十(shi)二烷(wan)基硫(liu)#鈉SDS溶液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離子水配制，室溫(wen)保(bao)存(cun)。

3、 分(fen)離膠緩沖液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混合(he)，加水稀(xi)釋到(dao)00ml終體(ti)積。過濾(lv)後(hou)40℃保(bao)存(cun)。

4、 濃縮(suo)膠緩沖液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於40mlH2O中(zhong)，用約(yue)48ml mol/L HCl調至pH6.8加水稀(xi)釋到(dao)00ml終體(ti)積。過濾(lv)後(hou)40C保(bao)存(cun)。這(zhe)兩(liang)種緩沖(chong)液必須(xu)使用Tris堿(jian)制(zhi)備(bei)，再用HCL調(tiao)節PH值，而(er)不(bu)用 Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液N，N，N’N’四(si)甲(jia)基乙(yi)二胺(an)催化(hua)過(guo)硫(liu)#銨形成(cheng)自(zi)由(you)基(ji)而(er)加速(su)兩種丙稀(xi)酰胺(an)的(de)聚合(he)。PH太低(di)時，聚合(he)反應(ying)受(shou)到(dao)抑(yi)制(zhi)。0%（w/v）過(guo)硫#胺(an)溶液。提供(gong)兩(liang)種(zhong)丙稀(xi)酰胺(an)聚合(he)所必須(xu)的(de)自(zi)由(you)基(ji)。去離子水配制數ml，臨用前配(pei)制(zhi).

6、 SDS- PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液(ye)8ml，甘(gan)油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基乙(yi)醇(chun)3.2ml，0.05%溴(xiu)酚藍(lan).6ml，H2O 32ml混勻備(bei)用。按:或:2比例(li)與蛋(dan)白質樣品混合(he)，在沸(fei)水終煮(zhu)3min混(hun)勻(yun)後(hou)再上樣，壹(yi)般(ban)為(wei)20-25ul，總(zong)蛋(dan)白量(liang)00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨(an)#電泳(yong)緩(huan)沖液:30.3gTris，88g甘(gan)氨(an)#，0gSDS，用蒸餾(liu)水溶解至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨(an)#電極(ji)緩(huan)沖(chong)液(ye)。臨(lin)用前稀(xi)釋0倍。

8、 轉移(yi)緩(huan)沖(chong)液(ye)：配制L轉移(yi)緩(huan)沖(chong)液(ye)，需(xu)稱取(qu)2.9g甘(gan)氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並加入(ru)200ml甲(jia)醇(chun)，加水至總量(liang)L。

9、 麗春紅(hong)染液儲(chu)存(cun)液(ye)：麗春紅(hong)S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺(huang)基(ji)水楊(yang)# 30g 加水至00ml 用時上述儲(chu)存(cun)液(ye)稀(xi)釋0倍即成(cheng)麗春紅(hong)S使用液。使用後應(ying)予以(yi)廢(fei)棄。

0、 脫脂(zhi)奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉（有(you)毒，戴手套操作(zuo)），溶(rong)於磷(lin)#緩(huan)沖(chong)鹽溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖(chong)鹽溶(rong)液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗(kang)人(ren)-MMP-9（6）鼠(shu)抗(kang)人(ren)-TIMP-。

4、 過氧化(hua)物(wu)酶標(biao)記(ji)的(de)第二(er)抗體(ti)。

5、 NBT（溶於70%二(er)甲基甲(jia)酰胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於00%二(er)甲基甲(jia)酰胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA
做(zuo)線粒體膜UCP2蛋(dan)白的(de)Western Blot （以(yi)下簡寫(xie)成(cheng)Western Blot），提取(qu)線粒體後凍(dong)存(cun)（未(wei)加蛋(dan)白酶抑(yi)制(zhi)劑(ji)），樣品不(bu)能反復凍(dong)融;，加蛋(dan)白酶抑(yi)制(zhi)劑(ji)。同(tong)時，建(jian)議(yi)檢查(zha)Western Blot過程， 提高壹(yi)抗(kang)濃度。對於加蛋(dan)白酶抑(yi)制(zhi)劑(ji)來說(shuo)，壹(yi)般(ban)加PMSF就(jiu)可以(yi)了，能多(duo)加幾(ji)中(zhong)種蛋(dan)白酶抑(yi)制(zhi)劑(ji)。
同(tong)壹(yi)蛋(dan)白樣品能同時進(jin)行兩(liang)種(zhong)因(yin)子的(de)Western Blot檢測(ce)，有(you)的(de)甚(shen)至可以(yi)同時測(ce)幾(ji)十(shi)種樣品。
如(ru)果是(shi)膜蛋白和胞(bao)漿(jiang)蛋白，所用的(de)去垢(gou)劑就(jiu)要溫(wen)和得多(duo)，這(zhe)時加上NaF去抑(yi)制(zhi)磷(lin)#化(hua)酶的(de)活性。
樣品的(de)蛋白含(han)量(liang)很(hen)低(di)，每微升(sheng)不(bu)到(dao)微(wei)克，但是在(zai)轉膜時經(jing)常會(hui)發現(xian)只有(you)壹(yi)部(bu)分(fen)蛋白轉到(dao)了膜(mo)上，就(jiu)是在(zai)轉膜後(hou)染(ran)膠發現(xian)有(you)的(de)孔所有(you)的(de)蛋白條(tiao)帶都在(zai)，只是(shi)顏色變淡(dan)了，可以(yi)加大上樣量(liang)，轉移(yi)時可以(yi)用減少(shao)電流(liu)延長(chang)時間，多(duo)加5-0%甲(jia)醇(chun)。
想(xiang)分(fen)離的(de)蛋白是分(fen)子量(liang)260kd的(de)，SDS-PAGE電泳(yong)的(de)分(fen)離膠濃度用6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的(de)蛋白不(bu)好(hao)做(zuo)
如(ru)果上樣量(liang)超(chao)載(zai)，可以(yi)濃縮(suo)樣品，也(ye)可以(yi)根(gen)據(ju)妳的(de)目(mu)標(biao)分(fen)子量(liang)透析(xi)掉壹(yi)部(bu)分(fen)小分(fen)子蛋白。壹(yi)般(ban)地(di)，超(chao)載(zai)30%是不(bu)會(hui)有(you)問題(ti)的(de)。如(ru)果已(yi)經(jing)超(chao)了不(bu)少(shao)了，而(er)且(qie)小(xiao)分(fen)子量(liang)的(de)也(ye)要(yao)，可以(yi)考慮加大膠的(de)厚(hou)度，可以(yi)試(shi)試(shi).5mm的(de) comb。
蛋白變性後(hou)存(cun)放-80℃，壹(yi)兩(liang)年(nian)沒(mei)有(you)問題(ti)，zui關(guan)鍵兩條(tiao)：不(bu)要(yao)被(bei)蛋白酶水解掉;不(bu)要(yao)被(bei)細菌(jun)消(xiao)化(hua)掉(diao)（也(ye)是(shi)被(bei)酶水解了）。
采(cai)用DAB顯色技術(shu)，二(er)抗是化(hua)的(de)多(duo)克隆(long)抗體(ti)，三(san)抗(kang)是(shi)親(qin)和(he)素體(ti)系(xi)，不(bu)能使用脫脂(zhi)奶粉，脫脂(zhi)奶粉會影響親(qin)和(he)素的(de)生成(cheng)，因(yin)為(wei)脫脂(zhi)奶粉中(zhong)含(han)，用BSA代(dai)替應(ying)該好(hao)壹(yi)點(dian).
Western Blot壹(yi)般(ban)上樣30-00微克不(bu)等(deng)，結果跟目(mu)的(de)蛋白的(de)豐度、上樣量(liang)、壹(yi)二(er)抗(kang)的(de)量(liang)和撫(fu)育時間都(dou)有(you)關(guan)系(xi)，也(ye)與(yu)顯色時間長(chang)短有(you)關(guan)。開(kai)始摸條(tiao)件(jian)時，為(wei)了拿到(dao)陽(yang)性結(jie)果，各(ge)個步(bu)驟都可以(yi)量(liang)多(duo)壹(yi)點(dian)時間長(chang)壹(yi)點(dian)，當(dang)然(ran)背(bei)景(jing)也(ye)就(jiu)出來了。要(yao)拿到(dao)好(hao)的(de)結果，如(ru)果抗(kang)體好的(de)話(hua)比較容易，抗體(ti)不(bu)好(hao)的(de)話(hua)就(jiu)需(xu)要反復地(di)試(shi)了，當(dang)然(ran)有(you)的(de)不(bu)適(shi)合(he)Western Blot的(de)怎(zen)樣做(zuo)也(ye)不(bu)行。所以(yi)拿到(dao)好(hao)的(de)結果不(bu)容易。