【概要描(miao)述(shu)】兔(tu)抗(kang)人(ren)胰(yi)多克隆抗(kang)體 試劑(ji)盒(he) Western免(mian)疫印(yin)跡(Western Blot)是(shi)將蛋白質轉(zhuan)移到膜(mo)上(shang)，然(ran)後(hou)利(li)用(yong)抗(kang)體進行(xing)檢測。

兔(tu)抗(kang)人(ren)胰(yi)多克隆抗(kang)體 試劑(ji)盒(he) Western Blot技術: 做(zuo)線粒(li)體膜(mo)UCP2蛋白的Western Blot （以下簡寫(xie)成Western Blot），提取線粒(li)體後(hou)凍(dong)存(cun)（未加蛋白酶(mei)抑制劑(ji)），樣(yang)品不能(neng)反復(fu)凍(dong)融(rong);，加蛋白酶(mei)抑制劑(ji)。同(tong)時(shi)，建議檢查Western Blot過(guo)程(cheng)， 提(ti)高(gao)壹(yi)抗(kang)濃(nong)度(du)。對(dui)於(yu)加蛋白酶(mei)抑制劑(ji)來(lai)說，壹(yi)般(ban)加PMSF就可以了，能多加幾中(zhong)種(zhong)蛋白酶(mei)抑制劑(ji)。
同(tong)壹(yi)蛋白樣(yang)品能同(tong)時(shi)進行(xing)兩種(zhong)因子的Western Blot檢測，有的甚(shen)至(zhi)可以同(tong)時(shi)測幾十(shi)種(zhong)樣(yang)兔(tu)抗(kang)人(ren)胰(yi)多克隆抗(kang)體 試劑(ji)盒(he)如(ru)果(guo)是(shi)膜(mo)蛋白和胞(bao)漿蛋白，所(suo)用(yong)的去(qu)垢劑(ji)就要溫(wen)和得(de)多，這時(shi)加上NaF去(qu)抑制磷#化(hua)酶(mei)的活性(xing)。
樣(yang)品的蛋白含(han)量很低(di)，每微(wei)升不到(dao)微(wei)克，但(dan)是(shi)在轉(zhuan)膜(mo)時(shi)經(jing)常(chang)會發現(xian)只有壹(yi)部(bu)分蛋白轉(zhuan)到(dao)了膜(mo)上(shang)，就是(shi)在轉(zhuan)膜(mo)後(hou)染膠發現(xian)有的孔所有的蛋白條(tiao)帶(dai)都(dou)在，只是(shi)顏色變(bian)淡了，可以加大上樣(yang)量，轉(zhuan)移時可(ke)以用(yong)減少電(dian)流(liu)延(yan)長時間(jian)，多加5-0%甲(jia)醇。
想分(fen)離(li)的蛋白是(shi)分子量260kd的，SDS-PAGE電(dian)泳(yong)的分離(li)膠(jiao)濃(nong)度(du)用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的蛋白不好(hao)做(zuo)
如(ru)果(guo)上樣(yang)量超載(zai)，可(ke)以濃(nong)縮(suo)樣(yang)品，也可以根據妳的目標分子量透(tou)析(xi)掉壹(yi)部(bu)分小分子蛋白。壹(yi)般(ban)地(di)，超載(zai)30%是(shi)不會有問題的。如(ru)果(guo)已經(jing)超了(le)不少(shao)了(le)，而且(qie)小分子量的也要，可(ke)以考慮加大膠的厚度，可(ke)以試試.5mm的 comb。
蛋白變(bian)性(xing)後(hou)存(cun)放-80℃，壹(yi)兩年沒有問題，zui關鍵兩條(tiao)：不要被蛋白酶(mei)水(shui)解(jie)掉(diao);不要被細(xi)菌(jun)消(xiao)化(hua)掉(diao)（也是(shi)被酶(mei)水(shui)解(jie)了(le)）。
采用(yong)DAB顯(xian)色技(ji)術，二(er)抗(kang)是(shi)化(hua)的多克隆抗(kang)體，三(san)抗(kang)是(shi)親(qin)和素體系，不能(neng)使(shi)用(yong)脫(tuo)脂奶(nai)粉，脫脂奶(nai)粉會影響親(qin)和素的生成，因(yin)為(wei)脫(tuo)脂奶(nai)粉中(zhong)含，用(yong)BSA代(dai)替應(ying)該好(hao)壹(yi)點(dian).Western Blot壹(yi)般(ban)上(shang)樣(yang)30-00微(wei)克不等(deng)，結果跟目的蛋白的豐度(du)、上(shang)樣(yang)量、壹(yi)二(er)抗(kang)的量和撫(fu)育(yu)時間(jian)都有關系，也與顯(xian)色時(shi)間(jian)長短(duan)有關。開(kai)始(shi)摸條(tiao)件(jian)時(shi)，為(wei)了(le)拿到陽性(xing)結果，各(ge)個步(bu)驟都(dou)可以量多壹(yi)點(dian)時間(jian)長壹(yi)點(dian)，當然(ran)背(bei)景(jing)也就出來(lai)了(le)。要拿到好(hao)的結果，如(ru)果(guo)抗(kang)體好的話(hua)比較容易，抗(kang)體不好(hao)的話(hua)就需(xu)要反復(fu)地(di)試了(le)，當(dang)然(ran)有的不適(shi)合(he)Western Blot的怎(zen)樣(yang)做(zuo)也不行(xing)。所(suo)以拿到好(hao)的結果不容(rong)易。

壹(yi)、 原理

與Southern或Northern雜交(jiao)方(fang)法類似(si)，但(dan)Western Blot采用(yong)的是(shi)聚(ju)丙烯酰胺凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳(yong)，被檢測物(wu)是(shi)蛋白質，“探(tan)針(zhen)”是(shi)抗(kang)體，“顯(xian)色”用(yong)標(biao)記的二(er)抗(kang)。經(jing)過(guo)PAGE分離(li)的蛋白質樣(yang)品，轉(zhuan)移到固(gu)相(xiang)載體（例如(ru)硝(xiao)#纖維(wei)素薄膜(mo)）上，固(gu)相(xiang)載體以非(fei)共價鍵(jian)形(xing)式吸附(fu)蛋白質，且(qie)能(neng)保(bao)持電(dian)泳(yong)分離(li)的多肽類(lei)型及其(qi)生物學活性(xing)不變(bian)。以固相載(zai)體上的蛋白質或(huo)多肽作為(wei)抗(kang)原，與對應(ying)的抗(kang)體起(qi)免(mian)疫反應(ying)，再(zai)與(yu)酶或(huo)同(tong)位(wei)素標記(ji)的第二(er)抗(kang)體起(qi)反應(ying)，經(jing)過(guo)底物(wu)顯(xian)色或(huo)放(fang)射(she)自顯(xian)影以檢測電(dian)泳(yong)分離(li)的特異性(xing)目的基(ji)因(yin)表(biao)達的蛋白成(cheng)分(fen)。該技(ji)術也廣泛應(ying)用(yong)於(yu)檢測蛋白水(shui)平(ping)的表(biao)達。

二(er)、分(fen)類(lei)  現(xian)常(chang)用(yong)的有底物(wu)化(hua)學發光(guang)ECL和底物(wu)DAB呈(cheng)色，體同(tong)水(shui)平(ping)和實(shi)驗(yan)條(tiao)件(jian)的是(shi)用(yong)*種(zhong)方法(fa)，目前發表(biao)文(wen)章(zhang)通常是(shi)用(yong)底物(wu)化(hua)學發光(guang)ECL。只要買(mai)現(xian)成(cheng)的試劑盒(he)就行，操作也比較簡單(dan)，原理如(ru)下(xia)（二(er)抗(kang)用(yong)HRP標記(ji)）：反應(ying)底物(wu)為(wei)過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)+魯(lu)米(mi)諾，如(ru)遇(yu)到HRP，即(ji)發光(guang)，可(ke)使(shi)膠片(pian)曝光(guang)，就可洗(xi)出條(tiao)帶(dai)。

三(san)、 主要試(shi)劑

、 丙烯酰胺和N，N’-亞甲(jia)雙丙烯酰胺，應(ying)以溫熱(re)（以利(li)於(yu)溶(rong)解雙(shuang)丙稀(xi)酰(xian)胺）的去(qu)離(li)子水(shui)配(pei)制(zhi)含(han)有29%（w/v）丙稀(xi)酰(xian)胺和%（w/v）N，N’-亞甲(jia)雙丙烯酰胺儲存(cun)液丙稀(xi)酰(xian)胺29g，N，N-亞甲(jia)叉雙(shuang)丙稀(xi)酰(xian)胺g，加H2O至(zhi) 00ml。）儲於(yu)棕色瓶(ping)，4℃避(bi)光(guang)保(bao)存(cun)。嚴格核實(shi)PH不得(de)超過(guo)7.0，因可(ke)以發生脫(tuo)氨(an)基(ji)反應(ying)是(shi)光(guang)催(cui)化(hua)或(huo)堿催化(hua)的。使用(yong)期(qi)不得(de)超過(guo)兩個月，隔幾個月須(xu)重(zhong)新(xin)配(pei)制(zhi)。如(ru)有沈(chen)澱，可(ke)以過濾。  2、 十(shi)二(er)烷(wan)基(ji)硫(liu)#鈉SDS溶(rong)液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子水(shui)配(pei)制(zhi)，室(shi)溫(wen)保(bao)存(cun)。

3、 分離(li)膠(jiao)緩沖(chong)液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合(he)，加水(shui)稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終(zhong)體積。過(guo)濾後(hou)40℃保(bao)存(cun)。

4、 濃(nong)縮(suo)膠(jiao)緩沖(chong)液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於(yu)40mlH2O中(zhong)，用(yong)約(yue)48ml mol/L HCl調至(zhi)pH6.8加水(shui)稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終(zhong)體積。過(guo)濾後(hou)40C保(bao)存(cun)。這兩種(zhong)緩沖(chong)液必(bi)須(xu)使(shi)用(yong)Tris堿制備，再用(yong)HCL調節(jie)PH值，而不用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原溶(rong)液N，N，N’N’四甲(jia)基(ji)乙(yi)二(er)胺催化(hua)過(guo)硫#銨形(xing)成(cheng)自由基(ji)而加速(su)兩種(zhong)丙稀(xi)酰(xian)胺的聚(ju)合。PH太低(di)時(shi)，聚(ju)合反應(ying)受(shou)到(dao)抑制。0%（w/v）過硫(liu)#胺溶(rong)液。提(ti)供(gong)兩種(zhong)丙稀(xi)酰(xian)胺聚(ju)合所(suo)必(bi)須(xu)的自由基(ji)。去(qu)離(li)子水(shui)配(pei)制(zhi)數(shu)ml，臨(lin)用(yong)前(qian)配制(zhi).

6、 SDS- PAGE加樣(yang)緩沖(chong)液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖(chong)液8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基(ji)乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚(fen)藍(lan).6ml，H2O 32ml混勻(yun)備(bei)用(yong)。按:或:2比例(li)與(yu)蛋白質樣(yang)品混合，在沸水(shui)終(zhong)煮3min混勻(yun)後(hou)再上樣(yang)，壹(yi)般(ban)為(wei)20-25ul，總蛋白量00μg。

7、 Tris-甘氨(an)#電(dian)泳(yong)緩沖(chong)液:30.3gTris，88g甘氨(an)#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾水(shui)溶(rong)解至(zhi)000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨(an)#電(dian)極緩沖(chong)液。臨(lin)用(yong)前(qian)稀釋(shi)0倍。

8、 轉(zhuan)移緩沖(chong)液：配(pei)制(zhi)L轉(zhuan)移緩沖(chong)液，需(xu)稱取2.9g甘氨(an)#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並加入(ru)200ml甲(jia)醇，加水(shui)至(zhi)總量L。

9、 麗春(chun)紅(hong)染液儲(chu)存(cun)液：麗(li)春(chun)紅(hong)S 2g 三(san)#乙#30g 磺(huang)基(ji)水(shui)楊(yang)# 30g 加水(shui)至(zhi)00ml 用(yong)時(shi)上述(shu)儲存(cun)液稀(xi)釋0倍即(ji)成(cheng)麗(li)春(chun)紅(hong)S使用(yong)液(ye)。使用(yong)後(hou)應(ying)予(yu)以廢棄。

0、 脫脂奶(nai)粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮(dan)鈉（有毒(du)，戴手套(tao)操作），溶(rong)於(yu)磷#緩沖(chong)鹽溶(rong)液（PBS）。

2、 Tris緩沖(chong)鹽溶(rong)液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗(kang)人(ren)-MMP-9（6）鼠抗(kang)人(ren)-TIMP-。

4、 過氧(yang)化(hua)物(wu)酶標記的第二(er)抗(kang)體。

5、 NBT（溶(rong)於(yu)70%二(er)甲(jia)基(ji)甲(jia)酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於(yu)00%二(er)甲(jia)基(ji)甲(jia)酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。