【概(gai)要描(miao)述(shu)】兔(tu)成(cheng)骨細(xi)胞的(de)相(xiang)關(guan)產(chan)品(pin)：MHCC-LM3人(ren)高(gao)轉(zhuan)移潛能肝癌細(xi)胞人(ren)原代下(xia)腔靜脈平(ping)滑(hua)肌(ji)細(xi)胞兔(tu)原(yuan)代三(san)叉(cha)神經(jing)星(xing)形(xing)膠質細(xi)胞兔(tu)原(yuan)代心肌(ji)細(xi)胞兔(tu)原(yuan)代淋巴(ba)管成(cheng)纖(xian)維細(xi)胞人(ren)原代臍血(xue)DC細(xi)胞大(da)鼠(shu)原代角膜基(ji)質細(xi)胞小鼠(shu)原(yuan)代膽囊(nang)上皮細(xi)胞兔(tu)原(yuan)代頸動脈平(ping)滑(hua)肌(ji)細(xi)胞雞原(yuan)代呼吸道上皮細(xi)胞

兔(tu)成(cheng)骨細(xi)胞

培養基(ji) 含FBS、生(sheng)長(chang)添加劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等

換(huan)液(ye)頻(pin)率 每(mei)2-3天(tian)換(huan)液(ye)壹次(ci)；

生(sheng)長(chang)特性(xing) 貼壁

細(xi)胞形態(tai) 梭形(xing)、多(duo)角形(xing)

傳(chuan)代特性(xing) 可傳3-5代左右(you)；3代以(yi)內狀態(tai)

消(xiao)化液 0.25%yi蛋(dan)白酶

培養條(tiao)件 氣相(xiang)：空氣，95%；CO2，5%

兔(tu)成(cheng)骨分離自(zi)顱(lu)骨組(zu)織；顱骨位於(yu)脊(ji)柱(zhu)上方，由23塊(kuai)形(xing)狀和(he)大(da)小(xiao)不同的(de)扁(bian)骨和(he)不規(gui)則(ze)骨組(zu)成。除下(xia)頜骨及(ji)舌骨外(wai)，其余各骨彼(bi)此(ci)借(jie)縫(feng)或(huo)軟骨牢固連(lian)結(jie)，起(qi)著(zhe)保(bao)護和(he)支(zhi)持(chi)腦(nao)、感(gan)覺器官(guan)以(yi)及(ji)消化器和(he)呼吸器的(de)起(qi)始部(bu)分的(de)作(zuo)用(yong)。顱(lu)分腦(nao)顱和(he)面顱兩部分。腦(nao)顱位於(yu)顱的(de)後(hou)上部，內有(you)顱腔，容納(na)腦(nao)，共8塊(kuai)。面顱為(wei)顱(lu)的(de)前(qian)下(xia)部分，包含眶(kuang)、鼻(bi)腔、口(kou)腔等結構(gou)，構(gou)成(cheng)面部的(de)支(zhi)架，共15塊(kuai)。成(cheng)骨細(xi)胞是(shi)骨形(xing)成的(de)主(zhu)要功(gong)能(neng)細(xi)胞，負責(ze)骨基(ji)質的(de)合(he)成(cheng)、分泌和(he)礦(kuang)化。骨不斷地(di)進(jin)行著(zhe)重建，骨重(zhong)建過(guo)程包括破(po)骨細(xi)胞貼附在(zai)舊骨區(qu)域(yu)，分泌酸(suan)性(xing)物質(zhi)溶解(jie)礦(kuang)物(wu)質(zhi)，分泌蛋(dan)白酶消(xiao)化骨基(ji)質，形(xing)成骨吸收陷(xian)窩；其(qi)後(hou)，成(cheng)骨細(xi)胞移行(xing)至(zhi)被(bei)吸收部位，分泌骨基(ji)質，骨基(ji)質礦(kuang)化而形成新骨；破(po)骨與成骨過(guo)程的(de)平(ping)衡(heng)是(shi)維持(chi)正常(chang)骨量(liang)的(de)關(guan)鍵。成(cheng)骨細(xi)胞培養不僅(jin)有(you)助於(yu)了解(jie)骨形(xing)成機制、骨骼系統疾(ji)病的(de)分子和(he)細(xi)胞學基(ji)礎，也是(shi)藥(yao)物篩選(xuan)、生(sheng)物材料(liao)開發(fa)和(he)生物工(gong)程研究(jiu)的(de)重(zhong)要手段(duan)。
方(fang)法簡介(jie)：

公(gong)司(si)實(shi)驗室分離的(de)兔(tu)成(cheng)骨采用先(xian)用(yong)yi蛋(dan)白酶短時(shi)間消化、後(hou)用(yong)膠原酶反(fan)復(fu)消(xiao)化制備而來，細(xi)胞總(zong)量(liang)約(yue)為(wei)5×10?cells/瓶(ping)。
質(zhi)量(liang)檢(jian)測(ce)：

公(gong)司(si)實(shi)驗室分離的(de)兔(tu)成(cheng)骨經(jing)ALP染(ran)色(se)檢(jian)測(ce)，純(chun)度(du)可達90%以(yi)上，且(qie)不含有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原(yuan)體、細(xi)菌(jun)、酵(jiao)母(mu)和(he)真(zhen)菌等(deng)。

壹、細(xi)胞培養

1取(qu)材 在(zai)無菌(jun)環(huan)境下(xia)從機體取(qu)出(chu)某(mou)種(zhong)組(zu)織(zhi)細(xi)胞（視實(shi)驗目(mu)的(de)而定），經(jing)過(guo)壹定的(de)處(chu)理（如消(xiao)化分散細(xi)胞、分離等(deng)）後(hou)接(jie)入(ru)培養器血(xue)中，這壹過(guo)程稱為(wei)取(qu)材。如(ru)是(shi)細(xi)胞株的(de)擴大(da)培養則(ze)無取(qu)材這壹過(guo)程。機體取(qu)出(chu)的(de)組(zu)織(zhi)細(xi)胞的(de)培養稱為(wei)原(yuan)代培養。2培養 將(jiang)取得(de)的(de)組(zu)織(zhi)細(xi)胞接(jie)入(ru)培養瓶(ping)或培養板(ban)中的(de)過(guo)程稱為(wei)培養。3凍(dong)存(cun)及(ji)復蘇（可參(can)閱(yue)後(hou)面有(you)關(guan)章節(jie)）為(wei)了(le)保(bao)存(cun)細(xi)胞，特別(bie)是(shi)不易獲(huo)得的(de)突變(bian)型(xing)細(xi)胞或細(xi)胞株，要將細(xi)胞凍(dong)存(cun)。凍(dong)存(cun)的(de)溫(wen)度(du)壹般(ban)用液氮(dan)的(de)溫(wen)度(du)－196℃，將(jiang)細(xi)胞收集(ji)至(zhi)凍(dong)存(cun)管中加(jia)入(ru)含保(bao)護劑(ji)（壹般(ban)為(wei)二(er)甲(jia)亞(ya)碸或甘油(you)）的(de)培養基(ji)，以(yi)壹定的(de)冷卻速度(du)凍(dong)存(cun)，最(zui)終(zhong)保(bao)存(cun)於(yu)液氮中。在(zai)極低(di)的(de)溫(wen)度(du)下(xia)，細(xi)胞保(bao)存(cun)的(de)時(shi)間幾乎(hu)是(shi)無限(xian)的(de)。復(fu)蘇壹般(ban)采用快融方(fang)法，即從液氮中取(qu)出(chu)凍(dong)存(cun)管後(hou)，立(li)即放(fang)入37℃水中，使(shi)之在(zai)壹分鐘(zhong)內迅(xun)速(su)融解(jie)。然後(hou)將(jiang)細(xi)胞轉(zhuan)入(ru)培養器皿中進(jin)行培養。

二(er)、原(yuan)代細(xi)胞分離

凡(fan)是(shi)來源(yuan)於(yu)胚胎、組(zu)織(zhi)器官(guan)及(ji)外(wai)周血(xue)，經(jing)特(te)殊(shu)分離方(fang)法制備而來的(de)原(yuan)初(chu)培養的(de)細(xi)胞稱之為(wei)原(yuan)代細(xi)胞。1懸浮細(xi)胞的(de)分離方(fang)法組織材料(liao)若來(lai)自血(xue)液(ye)、羊(yang)水、胸水或腹水的(de)懸(xuan)液(ye)材料(liao)，的(de)方(fang)法是(shi)采用1000r/min的(de)低(di)速(su)離(li)心(xin)10分鐘(zhong)。經(jing)離(li)心(xin)後(hou)由於(yu)各種(zhong)細(xi)胞的(de)比重不同可在(zai)分層液(ye)中形(xing)成(cheng)不同層，這樣可根據(ju)需要收獲(huo)目的(de)細(xi)胞。2實體組(zu)織(zhi)材料(liao)的(de)分離方(fang)法對(dui)於(yu)實體組(zu)織(zhi)材料(liao)，由於(yu)細(xi)胞間結合(he)緊密，為(wei)了(le)使(shi)組(zu)織中的(de)細(xi)胞充(chong)分分散，形成(cheng)細(xi)胞懸液(ye)，可采用機械(xie)分散法（物理裂解(jie)）和(he)消化分離法。

三(san)、細(xi)胞增殖(zhi)檢(jian)測(ce)技(ji)術

目(mu)前(qian)主(zhu)要有(you)兩種(zhong)用(yong)於(yu)檢(jian)測(ce)細(xi)胞增殖(zhi)能力(li)的(de)方(fang)法。壹種(zhong)是(shi)直接(jie)的(de)方(fang)法，通過(guo)直接(jie)測(ce)定進(jin)行分裂

的(de)細(xi)胞數來評價(jia)細(xi)胞的(de)增(zeng)殖(zhi)能力(li)。另壹種(zhong)是(shi)間接(jie)的(de)方(fang)法，即細(xi)胞活(huo)力（cell viability）檢(jian)測(ce)方法，通過(guo)檢(jian)測(ce)樣品(pin)中健(jian)康細(xi)胞的(de)數目來評價(jia)細(xi)胞的(de)增(zeng)殖(zhi)能力(li)。顯(xian)然，細(xi)胞活(huo)力檢(jian)測(ce)法並(bing)不能最(zui)終(zhong)證(zheng)明(ming)檢(jian)測(ce)樣品(pin)中的(de)細(xi)胞是(shi)否在(zai)增殖(zhi)。如細(xi)胞在(zai)某(mou)壹培養條(tiao)件下(xia)會自(zi)發(fa)啟(qi)動雕亡程序(xu)，但藥(yao)物的(de)幹(gan)擾(rao)可抑制雕亡的(de)發(fa)生(sheng)；這時(shi)若采用細(xi)胞活(huo)力檢(jian)測(ce)法，顯(xian)然可以(yi)區(qu)分兩種(zhong)條(tiao)件下(xia)的(de)細(xi)胞數量，但我們並(bing)不能從藥(yao)物幹擾(rao)組(zu)細(xi)胞數大(da)於(yu)對(dui)照(zhao)組的(de)事(shi)實(shi)說(shuo)明(ming)藥(yao)物可促進(jin)細(xi)胞增殖(zhi)的(de)結(jie)論。所以(yi)最(zui)直接(jie)的(de)證(zheng)據(ju)應該(gai)采用方(fang)法壹。

取(qu)材：首先(xian)，用(yong)培養液(ye)濕潤所取(qu)的(de)組(zu)織(zhi)材料(liao)，並(bing)用(yong)鋒(feng)利的(de)眼(yan)科剪(jian)去(qu)除附在(zai)其上的(de)脂(zhi)肪和(he)結締組(zu)織。接(jie)著(zhe)用(yong)平(ping)衡(heng)液(ye)（如(ru)PBS或Hanks液）漂洗，再用眼(yan)科彎剪(jian)將(jiang)組(zu)織(zhi)塊(kuai)剪(jian)成(cheng)小(xiao)塊(kuai)。多(duo)次(ci)用PBS或(huo)Hanks液(ye)漂洗(xi)，直到液體清(qing)亮、無(wu)油(you)滴為(wei)止(zhi)。

接(jie)種(zhong)：用(yong)濕潤的(de)吸管吸取切碎的(de)組(zu)織(zhi)塊(kuai)，輕(qing)輕吹到培養瓶(ping)皿中，並(bing)按壹定間距均(jun)勻放(fang)在(zai)培養瓶(ping)底(di)壁上。註意不要過(guo)多(duo)，確保(bao)組織塊(kuai)切(qie)面貼在(zai)培養瓶(ping)底(di)壁上。

培養：將(jiang)培養瓶(ping)翻轉(zhuan)，使(shi)瓶(ping)底(di)朝上，在(zai)種(zhong)植(zhi)了組(zu)織塊壹側(ce)的(de)對(dui)側(ce)面加足(zu)培養液(ye)，避免組織塊與培養液(ye)接(jie)觸(chu)，然後(hou)塞(sai)緊瓶(ping)塞。將(jiang)種(zhong)植(zhi)了組(zu)織塊的(de)壹側(ce)朝上，靜置於(yu)37℃培養箱中。待(dai)組(zu)織(zhi)塊(kuai)貼壁1到3小時(shi)後(hou)翻(fan)瓶(ping)，使(shi)貼壁的(de)組(zu)織(zhi)塊(kuai)浸(jin)沒(mei)在(zai)培養液(ye)中，繼(ji)續(xu)靜(jing)置。換(huan)液(ye)：每(mei)隔(ge)2到3天更換(huan)壹次(ci)培養液(ye)，或者(zhe)根(gen)據(ju)培養瓶(ping)種(zhong)顏(yan)色(se)的(de)變(bian)化確定換(huan)液(ye)時(shi)間。

壹、原(yuan)代細(xi)胞計(ji)數

將(jiang)血(xue)球計(ji)數板(ban)及(ji)蓋片(pian)用擦(ca)試幹(gan)凈(jing)，並(bing)將(jiang)蓋片(pian)蓋在(zai)計(ji)數板(ban)上。

將(jiang)細(xi)胞懸液(ye)吸出少許(xu)，滴加(jia)在(zai)蓋片(pian)邊緣，使懸(xuan)液充(chong)滿(man)蓋(gai)片(pian)和(he)計(ji)數板(ban)之間。

靜(jing)置(zhi)3分鐘(zhong)。

鏡(jing)下(xia)觀(guan)察，計(ji)算(suan)計(ji)數板(ban)四大(da)格(ge)細(xi)胞總(zong)數，壓線細(xi)胞只(zhi)計(ji)左側(ce)和(he)上方的(de)。然後(hou)按下(xia)式(shi)計(ji)算(suan)：

細(xi)胞數/ml＝4大(da)格(ge)細(xi)胞總(zong)數/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡下(xia)偶(ou)見由兩(liang)個(ge)以(yi)上細(xi)胞組成(cheng)的(de)細(xi)胞團，應按單(dan)個細(xi)胞計(ji)算(suan)，若細(xi)胞團占(zhan)10%以(yi)上，說(shuo)明(ming)分散不好，需重新制備細(xi)胞懸液(ye)。

二(er)、原(yuan)代細(xi)胞活(huo)力

將(jiang)細(xi)胞懸液(ye)以(yi)0.5ml加(jia)入(ru)試管中。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺盼蘭(lan)染(ran)液(ye)，染(ran)色(se)2壹3分鐘(zhong)。

吸取少許(xu)懸(xuan)液塗(tu)於(yu)載玻片(pian)上，加上蓋片(pian)。

鏡(jing)下(xia)取幾(ji)個任意視野(ye)分別(bie)計(ji)死細(xi)胞和(he)活(huo)細(xi)胞數，計(ji)細(xi)胞活(huo)力。

死(si)細(xi)胞能被(bei)臺(tai)盼蘭(lan)染(ran)上色(se)，鏡(jing)下(xia)可見深蘭(lan)色(se)的(de)細(xi)胞，活(huo)細(xi)胞不被(bei)染(ran)色(se)，鏡(jing)下(xia)呈無(wu)色(se)透(tou)明(ming)狀。

活(huo)力測定可以(yi)和(he)細(xi)胞計(ji)數合起來進(jin)行，但(dan)要考慮(lv)到染(ran)液(ye)對(dui)原(yuan)細(xi)胞懸液(ye)的(de)加(jia)倍稀(xi)釋(shi)作(zuo)用。