【概(gai)要(yao)描(miao)述(shu)】兔肌(ji)腱成纖維(wei)細(xi)胞(bao)的(de)相關(guan)產品：HLCs-SV40T人(ren)睪(gao)丸間(jian)質細(xi)胞(bao)人(ren)原(yuan)代半(ban)月(yue)板纖維(wei)軟骨細(xi)胞(bao)兔(tu)原(yuan)代腹(fu)腔(qiang)主(zhu)動脈(mai)外(wai)膜成纖維(wei)細(xi)胞(bao)大(da)鼠(shu)原(yuan)代乳(ru)腺(xian)上(shang)皮(pi)細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)原(yuan)代甲狀腺(xian)成纖維(wei)細(xi)胞(bao)人(ren)原(yuan)代成骨細(xi)胞(bao)人(ren)原(yuan)代氣(qi)管平滑肌(ji)細(xi)胞(bao)大(da)鼠(shu)原(yuan)代輸尿管上(shang)皮(pi)細(xi)胞(bao)人(ren)原(yuan)代CIK細(xi)胞(bao)大(da)鼠(shu)原(yuan)代前列(lie)腺(xian)成纖維(wei)細(xi)胞(bao)

兔(tu)肌(ji)腱成纖維(wei)細(xi)胞(bao)

培(pei)養(yang)基(ji) 含(han)FBS、生(sheng)長(chang)添加劑、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換(huan)液(ye)頻(pin)率(lv) 每2-3天(tian)換液(ye)壹(yi)次(ci)；

生(sheng)長(chang)特性 貼(tie)壁

細(xi)胞(bao)形(xing)態(tai) 成纖維(wei)細(xi)胞(bao)樣(yang)

傳代特性 可(ke)傳(chuan)3-5代左(zuo)右

消化液(ye) 0.25%yi蛋白(bai)酶(mei)

培(pei)養(yang)條(tiao)件(jian) 氣(qi)相(xiang)：空(kong)氣(qi)，95%；CO2，5%

兔肌(ji)腱成纖維(wei)分(fen)離自肌(ji)腱組(zu)織；肌(ji)腱是(shi)肌(ji)腹兩端的(de)索狀(zhuang)或膜狀致(zhi)密結(jie)締組織，便(bian)於肌(ji)肉附(fu)著(zhe)和(he)固定(ding)。壹(yi)塊(kuai)肌(ji)肉的(de)肌(ji)腱分(fen)附(fu)在兩塊或兩塊以(yi)上(shang)的(de)不同骨(gu)上(shang)，是由(you)於肌(ji)腱的(de)牽引(yin)作用(yong)才(cai)能(neng)使肌(ji)肉的(de)收(shou)縮帶動不(bu)同骨(gu)的(de)運(yun)動。每(mei)壹(yi)塊(kuai)骨骼肌(ji)都(dou)分(fen)成肌(ji)腹和(he)肌(ji)腱兩部(bu)分(fen)，肌(ji)腹由(you)肌(ji)纖維(wei)構(gou)成，色紅質(zhi)軟，有(you)收(shou)縮能力(li)，肌(ji)腱由(you)致(zhi)密結(jie)締組織構(gou)成，色乳白(bai)較硬，沒(mei)有(you)收(shou)縮能力(li)。肌(ji)腱把(ba)骨(gu)骼(ge)肌(ji)附(fu)著(zhe)於骨(gu)骼(ge)。長(chang)肌(ji)的(de)肌(ji)腱多(duo)呈(cheng)圓索狀(zhuang)，闊(kuo)肌(ji)的(de)肌(ji)腱闊(kuo)而薄(bo)，呈(cheng)膜狀，又叫腱(jian)膜。此處的(de)肌(ji)腹即為(wei)通(tong)常(chang)所(suo)說的(de)紅肌(ji)，而肌(ji)腱即為(wei)白(bai)肌(ji)，分(fen)別控制肌(ji)肉的(de)力(li)量(liang)、爆發力(li)和(he)耐(nai)力(li)。成纖維(wei)細(xi)胞(bao)是(shi)疏(shu)松結(jie)締組織的(de)主(zhu)要(yao)細(xi)胞(bao)成分(fen)，由(you)胚胎(tai)時(shi)期的(de)間(jian)充質(zhi)細(xi)胞(bao)分(fen)化而來；成纖維(wei)細(xi)胞(bao)較(jiao)大(da)，輪廓清楚，多(duo)為(wei)突(tu)起(qi)的(de)紡錘(chui)形(xing)或星(xing)形的(de)扁(bian)平狀結(jie)構，其(qi)細(xi)胞(bao)核呈(cheng)規(gui)則的(de)卵(luan)圓形，核仁大(da)而明(ming)顯。成纖維(wei)細(xi)胞(bao)功(gong)能活(huo)動旺(wang)盛(sheng)，細(xi)胞(bao)質(zhi)嗜(shi)弱堿性，具(ju)明(ming)顯的(de)蛋白(bai)質(zhi)合(he)成和(he)分(fen)泌活(huo)動，在(zai)壹(yi)定(ding)條件下，它(ta)可(ke)以(yi)實現(xian)跟纖維(wei)細(xi)胞(bao)的(de)互相轉(zhuan)化；成纖維(wei)細(xi)胞(bao)對不同程度(du)的(de)細(xi)胞(bao)變(bian)性(xing)、壞(huai)死(si)和(he)組(zu)織缺(que)損(sun)的(de)修(xiu)復有(you)著(zhe)十分(fen)重要(yao)的(de)作用(yong)。剛(gang)分(fen)離的(de)肺(fei)成纖維(wei)細(xi)胞(bao)呈(cheng)圓形、折光(guang)性良(liang)好(hao)，懸浮(fu)於培(pei)養(yang)基(ji)中。30min細(xi)胞(bao)貼(tie)壁，其中部(bu)分(fen)開始伸(shen)出(chu)偽(wei)足(zu)，表現(xian)為(wei)小(xiao)的(de)突(tu)起(qi)；6h後(hou)細(xi)胞(bao)基(ji)本(ben)貼(tie)壁wan全，伸(shen)展(zhan)成梭形，胞(bao)核清晰，分(fen)布(bu)較(jiao)均勻，散在生長(chang)，不聚(ju)集成團；細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)迅速，5-7天(tian)即呈(cheng)融合狀(zhuang)態(tai)，細(xi)胞(bao)排(pai)列(lie)緊密，有(you)的(de)交叉重疊生長(chang)，平坦(tan)、胞(bao)體(ti)較(jiao)大(da)，細(xi)胞(bao)質(zhi)透明(ming)，細(xi)胞(bao)核較大(da)，呈(cheng)橢(tuo)圓形，顏(yan)色(se)淡。細(xi)胞(bao)融合，並彼此(ci)連接成網(wang)狀；細(xi)胞(bao)呈(cheng)突(tu)起(qi)的(de)紡錘(chui)形(xing)或星(xing)形的(de)扁(bian)平分(fen)布(bu)。
方法(fa)簡(jian)介：

公(gong)司(si)實驗(yan)室(shi)分(fen)離的(de)兔肌(ji)腱成纖維(wei)采(cai)用(yong)混(hun)合(he)膠原(yuan)酶(mei)消化法(fa)結(jie)合差速貼壁法(fa)制備(bei)而來，細(xi)胞(bao)總(zong)量約(yue)為(wei)5×10?cells/瓶(ping)。
質量檢(jian)測：

公(gong)司(si)實驗(yan)室(shi)分(fen)離的(de)兔肌(ji)腱成纖維(wei)經(jing)Vimentin免(mian)疫(yi)熒(ying)光(guang)鑒(jian)定，純度(du)可達90%以(yi)上(shang)，且不(bu)含(han)有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原(yuan)體、細(xi)菌、酵母和(he)真(zhen)菌等(deng)。

壹(yi)、細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)

1取(qu)材(cai) 在(zai)無菌環(huan)境(jing)下從(cong)機體取出(chu)某種(zhong)組(zu)織細(xi)胞(bao)（視(shi)實(shi)驗(yan)目(mu)的(de)而定(ding)），經(jing)過(guo)壹(yi)定(ding)的(de)處理（如(ru)消化分(fen)散細(xi)胞(bao)、分(fen)離等(deng)）後(hou)接入(ru)培(pei)養(yang)器(qi)血中，這(zhe)壹(yi)過(guo)程稱為(wei)取(qu)材(cai)。如(ru)是(shi)細(xi)胞(bao)株的(de)擴大(da)培(pei)養(yang)則無取材(cai)這(zhe)壹(yi)過(guo)程。機體取出(chu)的(de)組織細(xi)胞(bao)的(de)培(pei)養(yang)稱(cheng)為(wei)原(yuan)代培(pei)養(yang)。2培(pei)養(yang) 將(jiang)取(qu)得的(de)組織細(xi)胞(bao)接入(ru)培(pei)養(yang)瓶(ping)或培(pei)養(yang)板(ban)中的(de)過(guo)程稱為(wei)培(pei)養(yang)。3凍(dong)存及復蘇（可(ke)參(can)閱後(hou)面(mian)有(you)關(guan)章節）為(wei)了(le)保存細(xi)胞(bao)，特別是(shi)不易獲(huo)得的(de)突(tu)變(bian)型細(xi)胞(bao)或細(xi)胞(bao)株，要將(jiang)細(xi)胞(bao)凍(dong)存。凍(dong)存的(de)溫度(du)壹(yi)般(ban)用(yong)液(ye)氮的(de)溫度(du)－196℃，將(jiang)細(xi)胞(bao)收(shou)集至(zhi)凍(dong)存管中加入(ru)含(han)保(bao)護(hu)劑(ji)（壹(yi)般(ban)為(wei)二(er)甲亞碸(feng)或甘(gan)油）的(de)培(pei)養(yang)基(ji)，以(yi)壹(yi)定(ding)的(de)冷卻(que)速度(du)凍存，最(zui)終保(bao)存於液(ye)氮中。在極(ji)低的(de)溫度(du)下，細(xi)胞(bao)保(bao)存的(de)時間(jian)幾乎是無限(xian)的(de)。復蘇壹(yi)般(ban)采(cai)用(yong)快(kuai)融方法(fa)，即從(cong)液(ye)氮中取出(chu)凍(dong)存管後，立(li)即放(fang)入(ru)37℃水中，使之在(zai)壹(yi)分(fen)鐘(zhong)內迅速融解(jie)。然後將(jiang)細(xi)胞(bao)轉(zhuan)入(ru)培(pei)養(yang)器(qi)皿中進行(xing)培(pei)養(yang)。

二(er)、原(yuan)代細(xi)胞(bao)分(fen)離

凡是來源於胚胎(tai)、組(zu)織器(qi)官及外(wai)周(zhou)血，經(jing)特殊分(fen)離方法(fa)制備(bei)而來的(de)原(yuan)初培(pei)養(yang)的(de)細(xi)胞(bao)稱(cheng)之(zhi)為(wei)原(yuan)代細(xi)胞(bao)。1懸浮(fu)細(xi)胞(bao)的(de)分(fen)離方法(fa)組織材(cai)料(liao)若(ruo)來自血液(ye)、羊水、胸水或腹水的(de)懸液(ye)材(cai)料(liao)，的(de)方法(fa)是采(cai)用1000r/min的(de)低速離心10分(fen)鐘(zhong)。經(jing)離心後由(you)於各(ge)種(zhong)細(xi)胞(bao)的(de)比(bi)重不(bu)同可(ke)在分(fen)層液(ye)中形成不同層，這(zhe)樣(yang)可根(gen)據(ju)需(xu)要(yao)收(shou)獲(huo)目(mu)的(de)細(xi)胞(bao)。2實(shi)體(ti)組(zu)織材(cai)料(liao)的(de)分(fen)離方法(fa)對於實(shi)體(ti)組(zu)織材(cai)料(liao)，由(you)於細(xi)胞(bao)間(jian)結(jie)合緊密，為(wei)了(le)使組織中的(de)細(xi)胞(bao)充(chong)分(fen)分(fen)散，形成細(xi)胞(bao)懸液(ye)，可采(cai)用機械分(fen)散法(fa)（物理裂解(jie)）和(he)消化分(fen)離法(fa)。

三、細(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)檢(jian)測技(ji)術

目(mu)前主(zhu)要(yao)有(you)兩種(zhong)用(yong)於檢(jian)測細(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)能(neng)力(li)的(de)方法(fa)。壹(yi)種(zhong)是(shi)直接的(de)方法(fa)，通過(guo)直接測(ce)定(ding)進行(xing)分(fen)裂

的(de)細(xi)胞(bao)數(shu)來評(ping)價細(xi)胞(bao)的(de)增(zeng)殖(zhi)能(neng)力(li)。另(ling)壹(yi)種(zhong)是(shi)間(jian)接的(de)方法(fa)，即細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)（cell viability）檢(jian)測方法(fa)，通過(guo)檢(jian)測樣品中健康(kang)細(xi)胞(bao)的(de)數目(mu)來評(ping)價細(xi)胞(bao)的(de)增(zeng)殖(zhi)能(neng)力(li)。顯然(ran)，細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢(jian)測法(fa)並不能最(zui)終證明(ming)檢(jian)測樣品中的(de)細(xi)胞(bao)是(shi)否(fou)在增(zeng)殖(zhi)。如(ru)細(xi)胞(bao)在(zai)某壹(yi)培(pei)養(yang)條(tiao)件(jian)下(xia)會自發啟(qi)動雕(diao)亡(wang)程序(xu)，但(dan)藥物(wu)的(de)幹擾(rao)可抑(yi)制雕(diao)亡(wang)的(de)發生(sheng)；這(zhe)時(shi)若(ruo)采(cai)用(yong)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢(jian)測法(fa)，顯然(ran)可(ke)以(yi)區(qu)分(fen)兩種(zhong)條(tiao)件(jian)下(xia)的(de)細(xi)胞(bao)數(shu)量(liang)，但(dan)我(wo)們並不能從(cong)藥(yao)物幹擾(rao)組細(xi)胞(bao)數(shu)大(da)於對照組的(de)事(shi)實說明(ming)藥物(wu)可促進(jin)細(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)的(de)結(jie)論。所(suo)以(yi)最直接的(de)證據應(ying)該(gai)采(cai)用(yong)方(fang)法(fa)壹(yi)。

取(qu)材(cai)：首(shou)先(xian)，用(yong)培(pei)養(yang)液(ye)濕(shi)潤所取的(de)組織材(cai)料(liao)，並用鋒利的(de)眼(yan)科剪(jian)去除附(fu)在其(qi)上(shang)的(de)脂(zhi)肪(fang)和(he)結(jie)締組織。接著(zhe)用平(ping)衡(heng)液(ye)（如(ru)PBS或Hanks液(ye)）漂洗(xi)，再用(yong)眼(yan)科彎(wan)剪將(jiang)組(zu)織塊(kuai)剪(jian)成小塊。多(duo)次用(yong)PBS或Hanks液(ye)漂洗(xi)，直到液(ye)體清亮(liang)、無油滴(di)為(wei)止(zhi)。

接種(zhong)：用(yong)濕(shi)潤的(de)吸管吸取切(qie)碎(sui)的(de)組織塊(kuai)，輕(qing)輕吹(chui)到培(pei)養(yang)瓶(ping)皿中，並按壹(yi)定(ding)間(jian)距均勻放(fang)在(zai)培(pei)養(yang)瓶(ping)底(di)壁上(shang)。註意(yi)不(bu)要過(guo)多(duo)，確(que)保(bao)組織塊(kuai)切(qie)面(mian)貼在(zai)培(pei)養(yang)瓶(ping)底(di)壁上(shang)。

培(pei)養(yang)：將(jiang)培(pei)養(yang)瓶(ping)翻轉，使瓶(ping)底(di)朝(chao)上(shang)，在種(zhong)植了組(zu)織塊(kuai)壹(yi)側(ce)的(de)對側面(mian)加足(zu)培(pei)養(yang)液(ye)，避免(mian)組(zu)織塊(kuai)與培(pei)養(yang)液(ye)接觸，然後(hou)塞(sai)緊瓶(ping)塞(sai)。將(jiang)種(zhong)植了組(zu)織塊(kuai)的(de)壹(yi)側(ce)朝(chao)上(shang)，靜置於37℃培(pei)養(yang)箱(xiang)中。待組(zu)織塊(kuai)貼(tie)壁1到3小(xiao)時後翻瓶(ping)，使貼壁的(de)組織塊(kuai)浸(jin)沒(mei)在培(pei)養(yang)液(ye)中，繼續(xu)靜(jing)置。換液(ye)：每隔(ge)2到3天(tian)更(geng)換(huan)壹(yi)次(ci)培(pei)養(yang)液(ye)，或者根據(ju)培(pei)養(yang)瓶(ping)種(zhong)顏(yan)色(se)的(de)變化確(que)定(ding)換液(ye)時間(jian)。

壹(yi)、原(yuan)代細(xi)胞(bao)計數

將(jiang)血球(qiu)計數板及蓋(gai)片(pian)用擦(ca)試(shi)幹(gan)凈，並將(jiang)蓋(gai)片(pian)蓋(gai)在(zai)計數板上(shang)。

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸液(ye)吸出(chu)少許(xu)，滴加在蓋(gai)片(pian)邊緣(yuan)，使懸液(ye)充滿(man)蓋(gai)片(pian)和(he)計數板之間(jian)。

靜置3分(fen)鐘(zhong)。

鏡下觀(guan)察(cha)，計算計數板四(si)大(da)格(ge)細(xi)胞(bao)總(zong)數，壓(ya)線細(xi)胞(bao)只(zhi)計左側和(he)上(shang)方的(de)。然後(hou)按下式(shi)計算：

細(xi)胞(bao)數(shu)/ml＝4大(da)格(ge)細(xi)胞(bao)總(zong)數/ 4×10000

註意(yi)：鏡下偶(ou)見(jian)由(you)兩個以(yi)上(shang)細(xi)胞(bao)組(zu)成的(de)細(xi)胞(bao)團(tuan)，應(ying)按單(dan)個細(xi)胞(bao)計算，若(ruo)細(xi)胞(bao)團(tuan)占(zhan)10%以(yi)上(shang)，說明(ming)分(fen)散不好，需(xu)重新(xin)制備(bei)細(xi)胞(bao)懸液(ye)。

二(er)、原(yuan)代細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸液(ye)以(yi)0.5ml加入(ru)試管中。

加入(ru)0.5ml 0.4%臺(tai)盼(pan)蘭染液(ye)，染色2壹(yi)3分(fen)鐘(zhong)。

吸(xi)取(qu)少許(xu)懸液(ye)塗於載(zai)玻(bo)片(pian)上(shang)，加上(shang)蓋(gai)片(pian)。

鏡下取(qu)幾個任(ren)意(yi)視(shi)野(ye)分(fen)別計死(si)細(xi)胞(bao)和(he)活(huo)細(xi)胞(bao)數(shu)，計細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)。

死(si)細(xi)胞(bao)能(neng)被臺(tai)盼(pan)蘭染上(shang)色，鏡下可(ke)見(jian)深(shen)蘭色(se)的(de)細(xi)胞(bao)，活(huo)細(xi)胞(bao)不(bu)被染色，鏡下呈(cheng)無色透明(ming)狀。

活(huo)力(li)測(ce)定可以(yi)和(he)細(xi)胞(bao)計數合起來進行(xing)，但(dan)要考慮(lv)到染液(ye)對原(yuan)細(xi)胞(bao)懸液(ye)的(de)加倍稀釋(shi)作用(yong)。