【概(gai)要(yao)描述(shu)】兔(tu)抗(kang)人(ren)肌動(dong)蛋白(bai)多(duo)克隆(long)抗(kang)體 Actin Western免疫印(yin)跡(ji)(Western Blot)是將(jiang)蛋白質轉移(yi)到膜上(shang)，然後利(li)用抗(kang)體進(jin)行檢測。

兔(tu)抗(kang)人(ren)肌動(dong)蛋白(bai)多(duo)克隆(long)抗(kang)體 Actin  Western Blot技(ji)術(shu): 做(zuo)線粒體膜UCP2蛋白(bai)的(de)Western Blot （以下簡(jian)寫(xie)成Western Blot），提(ti)取線粒體後凍(dong)存(cun)（未(wei)加蛋白(bai)酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)），樣(yang)品不(bu)能(neng)反(fan)復凍(dong)融;，加蛋白(bai)酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)。同時，建議(yi)檢(jian)查Western Blot過(guo)程， 提(ti)高(gao)壹抗(kang)濃度(du)。對於(yu)加蛋白(bai)酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)來說(shuo)，壹般(ban)加PMSF就(jiu)可(ke)以(yi)了，能(neng)多(duo)加幾中(zhong)種(zhong)蛋(dan)白酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)。
同壹(yi)蛋白樣(yang)品能(neng)同時進行(xing)兩(liang)種(zhong)因(yin)子的(de)Western Blot檢測，有的(de)甚(shen)至可(ke)以(yi)同時測幾十種(zhong)樣(yang) 兔(tu)抗(kang)人(ren)肌動(dong)蛋白(bai)多(duo)克隆(long)抗(kang)體 Actin 如(ru)果(guo)是膜(mo)蛋白(bai)和(he)胞(bao)漿(jiang)蛋白，所用的(de)去(qu)垢(gou)劑(ji)就(jiu)要(yao)溫(wen)和(he)得(de)多(duo)，這時加上(shang)NaF去(qu)抑(yi)制磷#化(hua)酶(mei)的(de)活性(xing)。
樣(yang)品的(de)蛋白含(han)量(liang)很(hen)低(di)，每(mei)微升不(bu)到微克，但是在(zai)轉膜(mo)時經常(chang)會發(fa)現(xian)只(zhi)有壹部分蛋(dan)白(bai)轉到了膜上(shang)，就(jiu)是在(zai)轉(zhuan)膜(mo)後染膠(jiao)發(fa)現(xian)有的(de)孔所有的(de)蛋白條(tiao)帶都在，只(zhi)是(shi)顏(yan)色(se)變(bian)淡了(le)，可(ke)以(yi)加大(da)上(shang)樣(yang)量，轉(zhuan)移(yi)時可(ke)以(yi)用減(jian)少(shao)電流(liu)延(yan)長時間，多(duo)加5-0%甲醇。
想分離(li)的(de)蛋白是(shi)分子(zi)量260kd的(de)，SDS-PAGE電泳(yong)的(de)分離(li)膠(jiao)濃(nong)度(du)用6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的(de)蛋白不(bu)好(hao)做(zuo)
如(ru)果(guo)上(shang)樣(yang)量超(chao)載(zai)，可(ke)以(yi)濃縮(suo)樣(yang)品，也(ye)可(ke)以(yi)根據妳的(de)目標(biao)分子(zi)量(liang)透析(xi)掉(diao)壹(yi)部分小(xiao)分子(zi)蛋白。壹般(ban)地，超載(zai)30%是不(bu)會(hui)有問題(ti)的(de)。如果(guo)已經(jing)超了(le)不(bu)少(shao)了，而(er)且小(xiao)分子(zi)量的(de)也(ye)要(yao)，可(ke)以(yi)考慮(lv)加大(da)膠(jiao)的(de)厚度，可(ke)以(yi)試試(shi).5mm的(de) comb。
蛋白變(bian)性(xing)後存(cun)放-80℃，壹(yi)兩(liang)年(nian)沒(mei)有問題(ti)，zui關鍵兩條(tiao)：不(bu)要(yao)被蛋(dan)白(bai)酶(mei)水(shui)解(jie)掉(diao);不(bu)要(yao)被細(xi)菌消(xiao)化(hua)掉(diao)（也(ye)是(shi)被酶(mei)水(shui)解(jie)了(le)）。
采(cai)用(yong)DAB顯(xian)色技(ji)術(shu)，二(er)抗(kang)是化(hua)的(de)多(duo)克隆(long)抗(kang)體，三抗(kang)是親和(he)素體系(xi)，不(bu)能(neng)使(shi)用脫(tuo)脂(zhi)奶粉，脫脂(zhi)奶粉會影(ying)響(xiang)親和(he)素的(de)生成，因為脫脂(zhi)奶粉中(zhong)含(han)，用(yong)BSA代(dai)替應(ying)該(gai)好(hao)壹點. 兔(tu)抗(kang)人(ren)肌動(dong)蛋白(bai)多(duo)克隆(long)抗(kang)體 Actin Western Blot壹(yi)般(ban)上(shang)樣(yang)30-00微克不(bu)等(deng)，結果(guo)跟(gen)目的(de)蛋白的(de)豐度(du)、上(shang)樣(yang)量、壹(yi)二抗(kang)的(de)量和(he)撫(fu)育時間都有關系，也(ye)與(yu)顯(xian)色時間長短(duan)有關。開(kai)始(shi)摸條(tiao)件時，為了(le)拿(na)到陽性(xing)結果(guo)，各個(ge)步(bu)驟(zhou)都可(ke)以(yi)量多(duo)壹點時間長壹點，當然(ran)背(bei)景(jing)也(ye)就(jiu)出來(lai)了(le)。要(yao)拿到好的(de)結果(guo)，如果(guo)抗(kang)體好(hao)的(de)話比較容(rong)易(yi)，抗(kang)體不(bu)好(hao)的(de)話就(jiu)需要(yao)反(fan)復地試了(le)，當然(ran)有的(de)不(bu)適(shi)合Western Blot的(de)怎(zen)樣(yang)做也(ye)不(bu)行(xing)。所以拿(na)到好的(de)結果(guo)不(bu)容(rong)易(yi)。

兔(tu)抗(kang)人(ren)肌動(dong)蛋白(bai)多(duo)克隆(long)抗(kang)體 Actin 壹(yi)、 原(yuan)理(li)

與(yu)Southern或(huo)Northern雜交(jiao)方(fang)法類(lei)似，但Western Blot采(cai)用(yong)的(de)是聚丙(bing)烯酰(xian)胺凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳(yong)，被檢(jian)測(ce)物是(shi)蛋(dan)白質，“探(tan)針”是(shi)抗(kang)體，“顯(xian)色”用(yong)標(biao)記的(de)二抗(kang)。經過(guo)PAGE分(fen)離(li)的(de)蛋白質(zhi)樣(yang)品，轉(zhuan)移(yi)到固相載(zai)體（例(li)如硝(xiao)#纖維素薄膜）上(shang)，固相載(zai)體以非(fei)共價(jia)鍵(jian)形式吸附蛋(dan)白(bai)質(zhi)，且能保(bao)持(chi)電泳(yong)分離(li)的(de)多(duo)肽類(lei)型及其(qi)生物學(xue)活(huo)性(xing)不(bu)變(bian)。以(yi)固相載(zai)體上(shang)的(de)蛋白質(zhi)或多(duo)肽作(zuo)為抗(kang)原(yuan)，與對(dui)應(ying)的(de)抗(kang)體起(qi)免疫反(fan)應(ying)，再與酶(mei)或同(tong)位(wei)素標(biao)記的(de)第(di)二抗(kang)體起(qi)反(fan)應(ying)，經(jing)過(guo)底(di)物顯(xian)色或(huo)放射自(zi)顯(xian)影(ying)以(yi)檢測電泳(yong)分離(li)的(de)特異(yi)性(xing)目的(de)基(ji)因(yin)表達(da)的(de)蛋白成分。該(gai)技(ji)術(shu)也(ye)廣(guang)泛應(ying)用(yong)於(yu)檢(jian)測(ce)蛋白水(shui)平(ping)的(de)表達(da)。

二(er)、分(fen)類(lei)  現常(chang)用的(de)有底(di)物化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)ECL和(he)底(di)物DAB呈(cheng)色(se)，體同水(shui)平(ping)和(he)實驗條(tiao)件的(de)是用*種(zhong)方(fang)法，目(mu)前(qian)發(fa)表(biao)文(wen)章(zhang)通(tong)常(chang)是用(yong)底(di)物化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)ECL。只(zhi)要(yao)買現成的(de)試劑(ji)盒就(jiu)行，操作(zuo)也(ye)比較簡(jian)單(dan)，原(yuan)理(li)如(ru)下(xia)（二(er)抗(kang)用HRP標(biao)記）：反(fan)應(ying)底(di)物為(wei)過(guo)氧化(hua)物+魯(lu)米(mi)諾，如(ru)遇到HRP，即(ji)發(fa)光(guang)，可(ke)使(shi)膠(jiao)片曝光(guang)，就(jiu)可(ke)洗(xi)出條(tiao)帶。

三、 主要(yao)試劑(ji)

、 丙(bing)烯酰(xian)胺和(he)N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙(bing)烯酰(xian)胺，應(ying)以(yi)溫(wen)熱（以(yi)利(li)於(yu)溶解雙(shuang)丙(bing)稀(xi)酰胺）的(de)去(qu)離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制(zhi)含(han)有29%（w/v）丙(bing)稀(xi)酰胺和(he)%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙(bing)烯酰(xian)胺儲(chu)存(cun)液丙(bing)稀(xi)酰胺29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉(cha)雙(shuang)丙(bing)稀(xi)酰胺g，加H2O至 00ml。）儲(chu)於(yu)棕(zong)色(se)瓶(ping)，4℃避(bi)光(guang)保存(cun)。嚴格核(he)實PH不(bu)得(de)超(chao)過(guo)7.0，因(yin)可(ke)以(yi)發(fa)生(sheng)脫(tuo)氨(an)基(ji)反(fan)應(ying)是(shi)光催(cui)化(hua)或(huo)堿(jian)催(cui)化(hua)的(de)。使(shi)用期(qi)不(bu)得(de)超(chao)過(guo)兩個月(yue)，隔幾個月(yue)須重(zhong)新配(pei)制(zhi)。如有沈澱，可(ke)以(yi)過(guo)濾。  2、 十二烷基(ji)硫(liu)#鈉(na)SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制(zhi)，室(shi)溫(wen)保存(cun)。

3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩(huan)沖(chong)液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混合，加水(shui)稀(xi)釋(shi)到00ml終(zhong)體(ti)積。過(guo)濾後40℃保(bao)存(cun)。

4、 濃(nong)縮(suo)膠(jiao)緩(huan)沖(chong)液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於(yu)40mlH2O中(zhong)，用(yong)約(yue)48ml mol/L HCl調至pH6.8加水(shui)稀(xi)釋(shi)到00ml終(zhong)體(ti)積。過(guo)濾後40C保(bao)存(cun)。這兩(liang)種(zhong)緩(huan)沖(chong)液必須(xu)使(shi)用Tris堿(jian)制備(bei)，再用HCL調節PH值，而(er)不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶液N，N，N’N’四甲(jia)基(ji)乙(yi)二胺催(cui)化(hua)過(guo)硫#銨(an)形成自(zi)由基(ji)而(er)加速(su)兩種(zhong)丙(bing)稀(xi)酰胺的(de)聚合。PH太(tai)低(di)時，聚合反(fan)應(ying)受(shou)到抑制。0%（w/v）過(guo)硫#胺溶液。提(ti)供(gong)兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀(xi)酰胺聚(ju)合所必須(xu)的(de)自(zi)由基(ji)。去(qu)離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制(zhi)數(shu)ml，臨(lin)用(yong)前(qian)配(pei)制(zhi).

6、 SDS- PAGE加樣(yang)緩(huan)沖(chong)液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖(chong)液8ml，甘(gan)油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚藍.6ml，H2O 32ml混勻(yun)備(bei)用。按:或(huo):2比例(li)與蛋(dan)白質(zhi)樣(yang)品混合，在(zai)沸(fei)水(shui)終(zhong)煮(zhu)3min混勻(yun)後再上(shang)樣(yang)，壹般(ban)為(wei)20-25ul，總蛋(dan)白(bai)量00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨(an)#電(dian)泳(yong)緩(huan)沖(chong)液:30.3gTris，88g甘(gan)氨(an)#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾水(shui)溶解至000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨(an)#電(dian)極(ji)緩(huan)沖(chong)液。臨(lin)用(yong)前(qian)稀(xi)釋(shi)0倍(bei)。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖(chong)液：配(pei)制(zhi)L轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖(chong)液，需(xu)稱(cheng)取2.9g甘(gan)氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入200ml甲(jia)醇，加水(shui)至總量(liang)L。

9、 麗春紅(hong)染液儲(chu)存(cun)液：麗春紅(hong)S 2g 三#乙(yi)#30g 磺基(ji)水(shui)楊(yang)# 30g 加水(shui)至00ml 用(yong)時上(shang)述儲(chu)存(cun)液稀(xi)釋(shi)0倍(bei)即(ji)成麗春紅(hong)S使(shi)用液。使(shi)用後應(ying)予(yu)以廢棄(qi)。

0、 脫(tuo)脂(zhi)奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮(dan)鈉(na)（有毒，戴手套(tao)操作(zuo)），溶於(yu)磷(lin)#緩(huan)沖(chong)鹽(yan)溶液（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖(chong)鹽(yan)溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗(kang)人(ren)-MMP-9（6）鼠(shu)抗(kang)人(ren)-TIMP-。

4、 過(guo)氧化(hua)物酶(mei)標(biao)記的(de)第(di)二抗(kang)體。

5、 NBT（溶於(yu)70%二(er)甲(jia)基(ji)甲(jia)酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於(yu)00%二(er)甲(jia)基(ji)甲(jia)酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。