【概要描(miao)述(shu)】鼠(shu)抗(kang)人(ren)肌(ji)動蛋(dan)白單克(ke)隆抗(kang)體 Actin Western免疫印跡(ji)(Western Blot)是將蛋白質(zhi)轉(zhuan)移(yi)到膜上(shang)，然後利(li)用抗(kang)體進行檢測。

鼠抗(kang)人(ren)肌(ji)動蛋(dan)白單克(ke)隆抗(kang)體 Actin Western Blot技(ji)術: 做(zuo)線粒(li)體膜UCP2蛋(dan)白的(de)Western Blot （以下(xia)簡(jian)寫成Western Blot），提(ti)取(qu)線粒(li)體後凍(dong)存（未加蛋白(bai)酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)），樣(yang)品不(bu)能反復(fu)凍(dong)融(rong);，加(jia)蛋白酶抑制(zhi)劑(ji)。同時，建(jian)議(yi)檢查Western Blot過(guo)程(cheng)， 提高(gao)壹(yi)抗(kang)濃(nong)度。對於(yu)加蛋白(bai)酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)來說，壹般(ban)加(jia)PMSF就(jiu)可以(yi)了，能多(duo)加幾(ji)中種(zhong)蛋(dan)白(bai)酶抑制(zhi)劑(ji)。
同壹蛋(dan)白(bai)樣(yang)品能同時進行兩(liang)種(zhong)因(yin)子的(de)Western Blot檢測(ce)，有的(de)甚至可以同時測(ce)幾(ji)十種(zhong)樣(yang) 鼠抗(kang)人(ren)肌(ji)動蛋(dan)白單克(ke)隆抗(kang)體 Actin如果是膜蛋(dan)白和胞漿蛋(dan)白(bai)，所用的(de)去垢(gou)劑(ji)就(jiu)要溫和得多(duo)，這時加(jia)上(shang)NaF去抑制(zhi)磷(lin)#化(hua)酶(mei)的(de)活性。
樣(yang)品的(de)蛋白(bai)含(han)量很(hen)低(di)，每微(wei)升不(bu)到微(wei)克(ke)，但(dan)是在轉(zhuan)膜時經(jing)常(chang)會(hui)發現(xian)只(zhi)有壹(yi)部分(fen)蛋(dan)白轉(zhuan)到了膜上(shang)，就(jiu)是在轉(zhuan)膜後(hou)染膠(jiao)發現(xian)有的(de)孔所有的(de)蛋白(bai)條(tiao)帶(dai)都在，只(zhi)是顏色變淡(dan)了，可以加(jia)大(da)上樣(yang)量，轉(zhuan)移(yi)時可(ke)以(yi)用減(jian)少(shao)電流延長(chang)時間，多(duo)加5-0%甲醇(chun)。
想分離(li)的(de)蛋白(bai)是分子量(liang)260kd的(de)，SDS-PAGE電泳的(de)分離(li)膠(jiao)濃(nong)度用6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的(de)蛋白(bai)不(bu)好(hao)做(zuo)
如(ru)果上樣(yang)量超(chao)載，可(ke)以濃(nong)縮(suo)樣(yang)品，也(ye)可以(yi)根據妳的(de)目標(biao)分(fen)子(zi)量透(tou)析(xi)掉(diao)壹(yi)部(bu)分小分(fen)子蛋白(bai)。壹(yi)般(ban)地(di)，超(chao)載30%是不會(hui)有問(wen)題的(de)。如果已(yi)經(jing)超了不少(shao)了，而(er)且(qie)小(xiao)分(fen)子(zi)量的(de)也要，可以(yi)考(kao)慮(lv)加大(da)膠(jiao)的(de)厚度，可以(yi)試(shi)試(shi).5mm的(de) comb。
蛋白(bai)變性後(hou)存放-80℃，壹兩(liang)年(nian)沒(mei)有問(wen)題，zui關(guan)鍵(jian)兩(liang)條(tiao)：不(bu)要被(bei)蛋(dan)白(bai)酶(mei)水解(jie)掉;不(bu)要被(bei)細(xi)菌消化掉（也是被(bei)酶(mei)水解(jie)了）。
采用DAB顯色技(ji)術，二抗(kang)是化的(de)多(duo)克(ke)隆抗(kang)體，三抗(kang)是親和素體系，不能使用脫(tuo)脂奶(nai)粉，脫(tuo)脂奶(nai)粉會(hui)影響(xiang)親和素的(de)生成(cheng)，因(yin)為脫(tuo)脂奶(nai)粉中(zhong)含(han)，用BSA代(dai)替(ti)應該(gai)好(hao)壹點(dian). 鼠抗(kang)人(ren)肌(ji)動蛋(dan)白單克(ke)隆抗(kang)體 ActinWestern Blot壹般(ban)上(shang)樣(yang)30-00微(wei)克(ke)不等(deng)，結果跟目的(de)蛋白(bai)的(de)豐(feng)度、上樣(yang)量、壹(yi)二抗(kang)的(de)量和撫育時間都有關(guan)系，也與(yu)顯(xian)色時間長(chang)短有關(guan)。開始(shi)摸條(tiao)件(jian)時，為了拿到陽性結果，各個(ge)步(bu)驟(zhou)都(dou)可以量多(duo)壹點(dian)時間長(chang)壹(yi)點(dian)，當(dang)然(ran)背(bei)景也(ye)就(jiu)出(chu)來了。要拿到好(hao)的(de)結果，如果抗(kang)體好(hao)的(de)話(hua)比較容易，抗(kang)體不好(hao)的(de)話(hua)就(jiu)需要反復(fu)地(di)試(shi)了，當(dang)然(ran)有的(de)不適合Western Blot的(de)怎樣(yang)做(zuo)也(ye)不行。所以(yi)拿到好(hao)的(de)結果不容易。

 鼠(shu)抗(kang)人(ren)肌(ji)動蛋(dan)白單克(ke)隆抗(kang)體 Actin壹、 原(yuan)理(li)

與Southern或Northern雜交(jiao)方(fang)法(fa)類(lei)似，但(dan)Western Blot采用的(de)是聚丙烯(xi)酰(xian)胺凝膠(jiao)電泳，被(bei)檢(jian)測(ce)物(wu)是蛋白質(zhi)，“探(tan)針(zhen)”是抗(kang)體，“顯色”用標記(ji)的(de)二抗(kang)。經(jing)過PAGE分離(li)的(de)蛋白(bai)質(zhi)樣(yang)品，轉(zhuan)移(yi)到固相(xiang)載(zai)體（例如(ru)硝(xiao)#纖維(wei)素薄(bo)膜）上，固(gu)相(xiang)載(zai)體以非(fei)共(gong)價(jia)鍵(jian)形(xing)式(shi)吸(xi)附蛋白質(zhi)，且(qie)能保持電(dian)泳分(fen)離(li)的(de)多(duo)肽(tai)類型(xing)及(ji)其(qi)生物(wu)學活性不(bu)變。以固(gu)相(xiang)載(zai)體上的(de)蛋白(bai)質(zhi)或多(duo)肽(tai)作為抗(kang)原(yuan)，與對應的(de)抗(kang)體起免疫反應，再(zai)與酶(mei)或同位(wei)素標(biao)記(ji)的(de)第(di)二抗(kang)體起反應，經過底(di)物(wu)顯色或放(fang)射(she)自顯(xian)影以檢(jian)測(ce)電泳分(fen)離(li)的(de)特異(yi)性(xing)目(mu)的(de)基因(yin)表(biao)達的(de)蛋白(bai)成(cheng)分(fen)。該(gai)技(ji)術也廣(guang)泛應用於(yu)檢測蛋(dan)白(bai)水平(ping)的(de)表(biao)達。

二、分類  現(xian)常(chang)用的(de)有底(di)物(wu)化學發(fa)光ECL和底(di)物(wu)DAB呈(cheng)色，體同水平(ping)和實(shi)驗(yan)條(tiao)件(jian)的(de)是用*種方(fang)法(fa)，目(mu)前發表(biao)文(wen)章(zhang)通常(chang)是用底(di)物(wu)化學發(fa)光ECL。只(zhi)要買現(xian)成(cheng)的(de)試(shi)劑盒(he)就(jiu)行，操作也比較簡(jian)單，原(yuan)理(li)如下（二抗(kang)用HRP標記(ji)）：反應底(di)物(wu)為過氧化物(wu)+魯米(mi)諾(nuo)，如(ru)遇到HRP，即(ji)發(fa)光，可(ke)使膠(jiao)片曝(pu)光，就(jiu)可洗出(chu)條(tiao)帶(dai)。

三、 主(zhu)要試(shi)劑

、 丙烯(xi)酰(xian)胺和N，N’-亞甲(jia)雙(shuang)丙(bing)烯(xi)酰胺，應以溫熱(re)（以利(li)於(yu)溶解(jie)雙丙(bing)稀酰(xian)胺）的(de)去離(li)子(zi)水配(pei)制(zhi)含(han)有29%（w/v）丙稀酰(xian)胺和%（w/v）N，N’-亞甲(jia)雙(shuang)丙(bing)烯(xi)酰胺儲存液丙稀酰(xian)胺29g，N，N-亞甲(jia)叉(cha)雙(shuang)丙(bing)稀酰(xian)胺g，加H2O至 00ml。）儲於(yu)棕色瓶，4℃避光保(bao)存。嚴(yan)格(ge)核實(shi)PH不得超(chao)過(guo)7.0，因(yin)可以(yi)發(fa)生脫(tuo)氨基(ji)反應是光催(cui)化(hua)或堿(jian)催(cui)化(hua)的(de)。使用期(qi)不(bu)得超(chao)過(guo)兩(liang)個(ge)月(yue)，隔(ge)幾(ji)個(ge)月(yue)須(xu)重(zhong)新(xin)配(pei)制。如有沈(chen)澱，可以(yi)過(guo)濾。  2、 十二烷基硫#鈉(na)SDS溶液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離(li)子(zi)水配(pei)制(zhi)，室(shi)溫保(bao)存。

3、 分離(li)膠(jiao)緩沖(chong)液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混(hun)合，加水稀釋(shi)到00ml終(zhong)體積。過(guo)濾(lv)後(hou)40℃保存。

4、 濃(nong)縮(suo)膠(jiao)緩沖(chong)液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於(yu)40mlH2O中，用約(yue)48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加水稀釋(shi)到00ml終(zhong)體積。過(guo)濾(lv)後(hou)40C保存。這兩(liang)種(zhong)緩(huan)沖(chong)液必(bi)須(xu)使用Tris堿(jian)制備(bei)，再(zai)用HCL調(tiao)節(jie)PH值，而(er)不用 Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶液(ye)N，N，N’N’四甲(jia)基(ji)乙(yi)二胺催(cui)化(hua)過(guo)硫(liu)#銨形(xing)成(cheng)自(zi)由(you)基而(er)加速(su)兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀酰(xian)胺的(de)聚合。PH太低(di)時，聚(ju)合反應受到抑制(zhi)。0%（w/v）過硫(liu)#胺溶液(ye)。提供(gong)兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀酰(xian)胺聚合所必(bi)須(xu)的(de)自由(you)基。去離(li)子(zi)水配(pei)制(zhi)數ml，臨(lin)用前配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加樣(yang)緩沖(chong)液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖(chong)液8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴酚(fen)藍.6ml，H2O 32ml混(hun)勻(yun)備(bei)用。按(an):或:2比例(li)與(yu)蛋(dan)白質(zhi)樣(yang)品混(hun)合，在沸(fei)水終(zhong)煮(zhu)3min混(hun)勻(yun)後再(zai)上樣(yang)，壹般(ban)為20-25ul，總蛋白量00μg。

7、 Tris-甘氨#電泳緩(huan)沖(chong)液:30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用蒸餾(liu)水溶解(jie)至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極(ji)緩(huan)沖(chong)液。臨(lin)用前稀釋(shi)0倍。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩沖(chong)液：配(pei)制L轉(zhuan)移(yi)緩沖(chong)液，需稱取(qu)2.9g甘氨#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加(jia)入(ru)200ml甲醇(chun)，加(jia)水至總量L。

9、 麗春紅(hong)染(ran)液儲存液：麗春紅(hong)S 2g 三#乙#30g 磺基(ji)水楊(yang)# 30g 加水至00ml 用時上(shang)述(shu)儲存液稀釋(shi)0倍即(ji)成(cheng)麗春紅(hong)S使用液。使用後應予以廢(fei)棄(qi)。

0、 脫(tuo)脂奶(nai)粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(na)（有毒(du)，戴(dai)手套操作），溶於(yu)磷(lin)#緩沖(chong)鹽溶液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖(chong)鹽溶液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗(kang)人(ren)-MMP-9（6）鼠抗(kang)人(ren)-TIMP-。

4、 過氧(yang)化(hua)物(wu)酶標(biao)記(ji)的(de)第(di)二抗(kang)體。

5、 NBT（溶於(yu)70%二甲基甲酰(xian)胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於(yu)00%二甲基甲酰(xian)胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。