【概要(yao)描(miao)述】鼠(shu)抗人α橫(heng)紋肌(ji)肌動(dong)蛋(dan)白(bai)單(dan)克隆(long)抗體(ti) Actin（Alpha-Sarcomeric） Western Blot)是將蛋白(bai)質(zhi)轉(zhuan)移到膜(mo)上，然後利(li)用(yong)抗體(ti)進(jin)行檢(jian)測(ce)。

鼠抗人α橫(heng)紋肌(ji)肌動(dong)蛋(dan)白(bai)單(dan)克隆(long)抗體(ti) Actin（Alpha-Sarcomeric）   Western Blot技術:

壹(yi)、 原(yuan)理

與(yu)Southern或(huo)Northern雜交方法類似，但Western Blot采用(yong)的(de)是聚丙烯(xi)酰胺(an)凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳，被(bei)檢(jian)測(ce)物(wu)是蛋(dan)白(bai)質(zhi)，“探(tan)針”是抗體(ti)，“顯(xian)色(se)”用(yong)標記的(de)二(er)抗。經(jing)過PAGE分離的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣(yang)品(pin)，轉(zhuan)移到固(gu)相(xiang)載(zai)體（例(li)如(ru)硝(xiao)#纖(xian)維(wei)素(su)薄膜(mo)）上，固相(xiang)載(zai)體以非共價(jia)鍵形式吸附(fu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)，且能保(bao)持(chi)電(dian)泳分離的(de)多(duo)肽類型及其(qi)生(sheng)物(wu)學(xue)活性(xing)不(bu)變。以固相(xiang)載(zai)體上的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)或(huo)多(duo)肽作為抗原(yuan)，與(yu)對(dui)應(ying)的(de)抗體(ti)起(qi)免疫反應(ying)，再與(yu)酶(mei)或(huo)同(tong)位素(su)標記的(de)第二(er)抗體(ti)起(qi)反應(ying)，經過(guo)底(di)物(wu)顯(xian)色(se)或(huo)放射自顯(xian)影以(yi)檢(jian)測(ce)電(dian)泳分離的(de)特異(yi)性(xing)目(mu)的(de)基因表達的(de)蛋(dan)白(bai)成分。該(gai)技術也廣(guang)泛(fan)應(ying)用(yong)於(yu)檢測(ce)蛋白(bai)水平的(de)表(biao)達。

二(er)、分類 鼠抗人α橫(heng)紋肌(ji)肌動(dong)蛋(dan)白(bai)單(dan)克隆(long)抗體(ti)    Actin（Alpha-Sarcomeric） 現(xian)常(chang)用(yong)的(de)有底(di)物(wu)化(hua)學(xue)發光(guang)ECL和底(di)物(wu)DAB呈色(se)，體(ti)同(tong)水平和(he)實(shi)驗(yan)條件(jian)的(de)是用(yong)*種方法，目前(qian)發表(biao)文章通常是用(yong)底(di)物(wu)化(hua)學(xue)發光(guang)ECL。只要買現(xian)成的(de)試(shi)劑盒(he)就行，操(cao)作(zuo)也比較簡(jian)單(dan)，原(yuan)理如(ru)下(xia)（二(er)抗用(yong)HRP標記）：反應(ying)底(di)物(wu)為過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)+魯米(mi)諾(nuo)，如(ru)遇到HRP，即(ji)發光(guang)，可(ke)使膠(jiao)片曝光(guang)，就可(ke)洗(xi)出(chu)條帶(dai)。

三、 主要(yao)試(shi)劑

、 丙(bing)烯酰胺(an)和(he)N，N’-亞甲雙(shuang)丙烯(xi)酰胺(an)，應(ying)以溫熱(re)（以利(li)於(yu)溶解(jie)雙(shuang)丙稀酰胺(an)）的(de)去離子水配制含(han)有29%（w/v）丙(bing)稀酰胺(an)和(he)%（w/v）N，N’-亞甲雙(shuang)丙烯(xi)酰胺(an)儲(chu)存液(ye)丙(bing)稀酰胺(an)29g，N，N-亞甲(jia)叉(cha)雙(shuang)丙稀酰胺(an)g，加H2O至(zhi) 00ml。）儲於(yu)棕色(se)瓶，4℃避光保(bao)存。嚴(yan)格核實(shi)PH不(bu)得(de)超過(guo)7.0，因可(ke)以發生(sheng)脫(tuo)氨基反應(ying)是光(guang)催(cui)化(hua)或(huo)堿(jian)催(cui)化(hua)的(de)。使(shi)用(yong)期不(bu)得(de)超過(guo)兩(liang)個月(yue)，隔(ge)幾(ji)個月(yue)須(xu)重新配(pei)制。如有沈(chen)澱，可(ke)以過(guo)濾(lv)。 鼠(shu)抗人α橫(heng)紋肌(ji)肌動(dong)蛋(dan)白(bai)單(dan)克隆(long)抗體(ti) Actin（Alpha-Sarcomeric）  2、 十(shi)二(er)烷(wan)基硫#鈉SDS溶液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離子水配制，室溫保(bao)存。

3、 分離膠(jiao)緩沖液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混(hun)合(he)，加水稀釋到00ml終(zhong)體積(ji)。過濾(lv)後40℃保(bao)存。

4、 濃(nong)縮(suo)膠(jiao)緩沖液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於(yu)40mlH2O中，用(yong)約48ml mol/L HCl調至(zhi)pH6.8加水稀釋到00ml終(zhong)體積(ji)。過濾(lv)後40C保(bao)存。這兩(liang)種(zhong)緩沖液(ye)必(bi)須(xu)使用(yong)Tris堿(jian)制備，再(zai)用(yong)HCL調節PH值，而不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶液(ye)N，N，N’N’四(si)甲基乙(yi)二(er)胺(an)催(cui)化(hua)過硫#銨形(xing)成自由基而加(jia)速(su)兩(liang)種(zhong)丙稀酰胺(an)的(de)聚合。PH太低時，聚合反應(ying)受到抑(yi)制。0%（w/v）過(guo)硫#胺(an)溶(rong)液(ye)。提(ti)供(gong)兩(liang)種(zhong)丙稀酰胺(an)聚合所(suo)必須的(de)自由基。去離子水配制數(shu)ml，臨用(yong)前配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加(jia)樣(yang)緩(huan)沖液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液(ye)8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基乙(yi)醇(chun)3.2ml，0.05%溴(xiu)酚(fen)藍.6ml，H2O 32ml混勻(yun)備(bei)用(yong)。按:或(huo):2比例與(yu)蛋白(bai)質(zhi)樣(yang)品(pin)混(hun)合(he)，在(zai)沸(fei)水終煮(zhu)3min混勻(yun)後再上樣(yang)，壹(yi)般為20-25ul，總(zong)蛋白(bai)量(liang)00μg。

7、 Tris-甘氨#電(dian)泳緩(huan)沖液(ye):30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水溶解(jie)至(zhi)000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電(dian)極(ji)緩沖液(ye)。臨用(yong)前稀釋0倍(bei)。

8、 轉(zhuan)移緩沖液(ye)：配(pei)制L轉(zhuan)移緩沖液(ye)，需(xu)稱(cheng)取(qu)2.9g甘氨#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入(ru)200ml甲醇，加(jia)水至(zhi)總(zong)量(liang)L。

9、 麗春紅染液(ye)儲(chu)存液(ye)：麗(li)春紅S 2g 三#乙(yi)#30g 磺(huang)基水楊# 30g 加(jia)水至(zhi)00ml 用(yong)時上述儲(chu)存液(ye)稀釋0倍(bei)即(ji)成麗春紅S使(shi)用(yong)液(ye)。使(shi)用(yong)後應(ying)予以廢棄(qi)。

0、 脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(na)（有毒，戴(dai)手(shou)套操(cao)作），溶於(yu)磷(lin)#緩沖鹽(yan)溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖鹽(yan)溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗人-MMP-9（6）鼠(shu)抗人-TIMP-。

4、 過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)酶(mei)標記的(de)第二(er)抗體(ti)。

5、 NBT（溶(rong)於(yu)70%二(er)甲(jia)基甲酰胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於(yu)00%二(er)甲(jia)基甲酰胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA 鼠抗人α橫(heng)紋肌(ji)肌動(dong)蛋(dan)白(bai)單(dan)克隆(long)抗體(ti) Actin（Alpha-Sarcomeric）  做線(xian)粒(li)體(ti)膜(mo)UCP2蛋白(bai)的(de)Western Blot （以(yi)下(xia)簡(jian)寫(xie)成Western Blot），提取(qu)線粒體後凍存（未(wei)加(jia)蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)制劑），樣(yang)品(pin)不(bu)能反復凍融;，加(jia)蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)制劑。同(tong)時，建議(yi)檢查Western Blot過程(cheng)， 提高壹(yi)抗濃(nong)度(du)。對(dui)於(yu)加蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)制劑來(lai)說(shuo)，壹(yi)般加PMSF就可(ke)以了(le)，能多加(jia)幾(ji)中種(zhong)蛋白(bai)酶(mei)抑(yi)制劑。
同(tong)壹(yi)蛋白(bai)樣(yang)品(pin)能同(tong)時進(jin)行兩(liang)種(zhong)因子的(de)Western Blot檢(jian)測，有的(de)甚(shen)至(zhi)可(ke)以同(tong)時測幾(ji)十(shi)種樣(yang)品(pin)。
如(ru)果是膜(mo)蛋白(bai)和(he)胞(bao)漿(jiang)蛋白(bai)，所(suo)用(yong)的(de)去垢劑(ji)就要溫和(he)得(de)多，這時加上NaF去抑(yi)制磷(lin)#化(hua)酶(mei)的(de)活性(xing)。
樣(yang)品(pin)的(de)蛋(dan)白(bai)含(han)量(liang)很(hen)低(di)，每微升不到微克，但是在(zai)轉(zhuan)膜(mo)時經常(chang)會發現(xian)只有壹(yi)部分蛋白(bai)轉(zhuan)到了(le)膜(mo)上，就是在(zai)轉(zhuan)膜(mo)後染膠(jiao)發現(xian)有的(de)孔(kong)所有的(de)蛋(dan)白(bai)條帶(dai)都在(zai)，只是顏(yan)色(se)變(bian)淡了(le)，可(ke)以加(jia)大上樣(yang)量(liang)，轉(zhuan)移時可(ke)以用(yong)減(jian)少電(dian)流(liu)延長(chang)時間(jian)，多(duo)加(jia)5-0%甲(jia)醇(chun)。
想(xiang)分離的(de)蛋(dan)白(bai)是分子量(liang)260kd的(de)，SDS-PAGE電(dian)泳的(de)分離膠(jiao)濃(nong)度(du)用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的(de)蛋(dan)白(bai)不(bu)好(hao)做
如(ru)果上樣(yang)量(liang)超(chao)載，可(ke)以濃(nong)縮(suo)樣(yang)品(pin)，也可(ke)以根(gen)據妳的(de)目(mu)標分子量(liang)透析(xi)掉(diao)壹(yi)部分小(xiao)分子蛋(dan)白(bai)。壹(yi)般地，超(chao)載(zai)30%是不(bu)會有問題(ti)的(de)。如(ru)果已(yi)經超(chao)了(le)不(bu)少了(le)，而且(qie)小(xiao)分子量(liang)的(de)也要，可(ke)以考(kao)慮(lv)加(jia)大膠(jiao)的(de)厚度(du)，可(ke)以試(shi)試(shi).5mm的(de) comb。
蛋(dan)白(bai)變(bian)性(xing)後存放-80℃，壹(yi)兩(liang)年沒(mei)有問題(ti)，zui關鍵兩(liang)條：不(bu)要被(bei)蛋(dan)白(bai)酶(mei)水解掉(diao);不(bu)要(yao)被細菌消化(hua)掉(diao)（也是被(bei)酶(mei)水解了(le)）。
采用(yong)DAB顯(xian)色(se)技術，二(er)抗是化(hua)的(de)多(duo)克隆抗體(ti)，三抗是親和素(su)體系(xi)，不能使用(yong)脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉，脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉會(hui)影響(xiang)親和素(su)的(de)生(sheng)成，因為脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉中(zhong)含(han)，用(yong)BSA代替應(ying)該(gai)好(hao)壹(yi)點.
Western Blot壹(yi)般上樣(yang)30-00微克不等，結果跟目(mu)的(de)蛋(dan)白(bai)的(de)豐(feng)度、上樣(yang)量(liang)、壹(yi)二(er)抗的(de)量(liang)和(he)撫(fu)育(yu)時間(jian)都(dou)有關系，也與(yu)顯(xian)色(se)時間(jian)長(chang)短(duan)有關。開始(shi)摸條件(jian)時，為了(le)拿(na)到陽性(xing)結果，各(ge)個步(bu)驟(zhou)都可(ke)以量(liang)多(duo)壹(yi)點時間(jian)長(chang)壹(yi)點，當然背景也就出(chu)來(lai)了(le)。要(yao)拿(na)到好(hao)的(de)結果，如果抗體(ti)好(hao)的(de)話(hua)比較容易，抗體(ti)不好(hao)的(de)話(hua)就需要(yao)反復地試(shi)了(le)，當然有的(de)不(bu)適合Western Blot的(de)怎(zen)樣(yang)做也不行。所(suo)以(yi)拿(na)到好(hao)的(de)結果不容易。