【概(gai)要描(miao)述】兔抗(kang)人(ren)甲胎(tai)蛋(dan)白(bai)多克隆抗(kang)體(ti) AFP(Alpha Fetoprotein) (Western Blot)是(shi)將蛋(dan)白質(zhi)轉移(yi)到(dao)膜上(shang)，然後利(li)用(yong)抗(kang)體(ti)進(jin)行(xing)檢(jian)測(ce)。

兔(tu)抗(kang)人(ren)甲胎(tai)蛋(dan)白(bai)多克隆抗(kang)體(ti) AFP（Alpha Fetoprotein） Western Blot技術(shu):

壹(yi)、 原(yuan)理

與(yu)Southern或Northern雜交(jiao)方法類(lei)似，但Western Blot采用的是(shi)聚丙(bing)烯酰胺凝膠(jiao)電(dian)泳，被(bei)檢(jian)測(ce)物(wu)是(shi)蛋白(bai)質(zhi)，“探針(zhen)”是(shi)抗(kang)體(ti)，“顯色(se)”用標記(ji)的二抗(kang)。經過PAGE分離的蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣品(pin)，轉(zhuan)移到(dao)固相載(zai)體(ti)（例如(ru)硝(xiao)#纖維(wei)素(su)薄(bo)膜）上(shang)，固(gu)相載(zai)體(ti)以(yi)非共價(jia)鍵(jian)形式吸(xi)附蛋(dan)白(bai)質(zhi)，且(qie)能保(bao)持(chi)電泳分離的多(duo)肽(tai)類(lei)型(xing)及其(qi)生物(wu)學活性(xing)不變(bian)。以(yi)固(gu)相載(zai)體(ti)上(shang)的蛋(dan)白(bai)質(zhi)或多(duo)肽作(zuo)為(wei)抗(kang)原(yuan)，與(yu)對應的抗(kang)體(ti)起免(mian)疫反(fan)應(ying)，再(zai)與(yu)酶(mei)或同位(wei)素標記(ji)的第(di)二抗(kang)體(ti)起反(fan)應(ying)，經(jing)過(guo)底(di)物(wu)顯(xian)色(se)或(huo)放射(she)自顯影以(yi)檢(jian)測(ce)電(dian)泳分離的特異性(xing)目的基(ji)因表達(da)的蛋(dan)白(bai)成分。該(gai)技術也(ye)廣(guang)泛(fan)應(ying)用(yong)於檢(jian)測(ce)蛋(dan)白水平的表達(da)。

二、分類(lei)  現(xian)常用的有(you)底(di)物(wu)化(hua)學發光ECL和底(di)物(wu)DAB呈色(se)，體(ti)同水平和實(shi)驗(yan)條件(jian)的是(shi)用*種(zhong)方(fang)法，目前發(fa)表文(wen)章(zhang)通(tong)常是(shi)用底(di)物(wu)化(hua)學發光ECL。只(zhi)要買(mai)現(xian)成(cheng)的試(shi)劑(ji)盒就(jiu)行(xing)，操(cao)作(zuo)也(ye)比(bi)較簡(jian)單(dan)，原(yuan)理如(ru)下（二抗(kang)用HRP標記(ji)）：反應(ying)底(di)物(wu)為(wei)過(guo)氧(yang)化(hua)物+魯(lu)米諾(nuo)，如遇(yu)到(dao)HRP，即發(fa)光，可使膠(jiao)片曝(pu)光，就(jiu)可(ke)洗(xi)出(chu)條(tiao)帶。 兔抗(kang)人(ren)甲胎(tai)蛋(dan)白(bai)多克隆抗(kang)體(ti) AFP（Alpha Fetoprotein）

三、 主(zhu)要(yao)試(shi)劑(ji)

、 丙烯酰胺和N，N’-亞甲(jia)雙丙烯酰胺，應以(yi)溫熱（以(yi)利(li)於溶(rong)解(jie)雙丙稀(xi)酰胺）的去離子(zi)水配制含(han)有(you)29%（w/v）丙稀(xi)酰胺和%（w/v）N，N’-亞甲(jia)雙丙烯酰胺儲存(cun)液(ye)丙稀(xi)酰胺29g，N，N-亞甲(jia)叉雙丙稀(xi)酰胺g，加H2O至 00ml。）儲於(yu)棕(zong)色(se)瓶(ping)，4℃避光保(bao)存(cun)。嚴(yan)格(ge)核(he)實(shi)PH不得(de)超(chao)過(guo)7.0，因可(ke)以(yi)發(fa)生脫氨基反應(ying)是(shi)光催化(hua)或堿(jian)催化(hua)的。使用(yong)期(qi)不得(de)超(chao)過(guo)兩個月，隔(ge)幾個月須(xu)重(zhong)新配制。如(ru)有(you)沈澱，可以(yi)過(guo)濾(lv)。  2、 十二烷基硫(liu)#鈉(na)SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離子(zi)水配制，室溫保(bao)存(cun)。

3、 分離膠緩沖(chong)液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合(he)，加水稀釋(shi)到(dao)00ml終體(ti)積。過(guo)濾(lv)後40℃保(bao)存(cun)。

4、 濃(nong)縮膠緩沖(chong)液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於40mlH2O中(zhong)，用約(yue)48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加水稀釋(shi)到(dao)00ml終體(ti)積。過(guo)濾(lv)後40C保(bao)存(cun)。這(zhe)兩(liang)種(zhong)緩沖(chong)液(ye)必(bi)須使用(yong)Tris堿制備，再(zai)用HCL調(tiao)節PH值，而不用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液(ye)N，N，N’N’四甲基(ji)乙二胺催化(hua)過硫(liu)#銨形成(cheng)自由基(ji)而加速兩種(zhong)丙(bing)稀酰胺的聚(ju)合(he)。PH太低(di)時(shi)，聚合反(fan)應受(shou)到(dao)抑制。0%（w/v）過硫(liu)#胺溶(rong)液(ye)。提供(gong)兩種(zhong)丙(bing)稀酰胺聚合(he)所(suo)必(bi)須的自由基(ji)。去離子(zi)水配制數(shu)ml，臨用(yong)前(qian)配制.

6、 SDS- PAGE加樣緩沖(chong)液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖(chong)液(ye)8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙(yi)醇(chun)3.2ml，0.05%溴酚(fen)藍.6ml，H2O 32ml混勻備用。按:或:2比例與(yu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣品(pin)混(hun)合，在沸(fei)水終煮3min混勻後(hou)再(zai)上(shang)樣(yang)，壹(yi)般(ban)為20-25ul，總(zong)蛋白(bai)量00μg。

7、 Tris-甘氨(an)#電泳(yong)緩沖(chong)液(ye):30.3gTris，88g甘氨(an)#，0gSDS，用蒸(zheng)餾水溶(rong)解(jie)至000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨(an)#電極(ji)緩沖(chong)液(ye)。臨用(yong)前(qian)稀釋(shi)0倍。

8、 轉移(yi)緩沖(chong)液(ye)：配制L轉移(yi)緩沖(chong)液(ye)，需稱取2.9g甘氨(an)#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並加入200ml甲醇(chun)，加水至總(zong)量L。

9、 麗春紅(hong)染(ran)液(ye)儲存(cun)液(ye)：麗春紅(hong)S 2g 三#乙#30g 磺基(ji)水楊# 30g 加水至00ml 用時(shi)上(shang)述(shu)儲(chu)存(cun)液(ye)稀釋(shi)0倍即(ji)成(cheng)麗春紅(hong)S使用(yong)液(ye)。使用(yong)後(hou)應予(yu)以(yi)廢(fei)棄。

0、 脫脂奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮(dan)鈉(na)（有毒(du)，戴(dai)手套操(cao)作(zuo)），溶(rong)於磷(lin)#緩沖(chong)鹽溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖(chong)鹽溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗(kang)人(ren)-MMP-9（6）鼠(shu)抗(kang)人(ren)-TIMP-。

4、 過氧(yang)化(hua)物酶(mei)標記(ji)的第(di)二抗(kang)體(ti)。

5、 NBT（溶(rong)於70%二甲(jia)基甲(jia)酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於00%二甲(jia)基甲(jia)酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L  兔抗(kang)人(ren)甲胎(tai)蛋(dan)白(bai)多克隆抗(kang)體(ti) AFP（Alpha Fetoprotein）  做(zuo)線粒體(ti)膜UCP2蛋(dan)白的Western Blot （以(yi)下(xia)簡(jian)寫成(cheng)Western Blot），提(ti)取(qu)線粒體(ti)後凍(dong)存(cun)（未(wei)加蛋白(bai)酶(mei)抑制劑(ji)），樣(yang)品(pin)不能反(fan)復凍融(rong);，加蛋白(bai)酶(mei)抑制劑(ji)。同時(shi)，建(jian)議(yi)檢(jian)查Western Blot過程(cheng)， 提高(gao)壹(yi)抗(kang)濃(nong)度。對於加蛋白(bai)酶(mei)抑制劑(ji)來(lai)說，壹(yi)般加PMSF就(jiu)可(ke)以(yi)了(le)，能多(duo)加幾中(zhong)種(zhong)蛋(dan)白酶(mei)抑制劑(ji)。
同壹蛋白樣(yang)品(pin)能同時(shi)進(jin)行(xing)兩種(zhong)因子(zi)的Western Blot檢(jian)測(ce)，有(you)的甚(shen)至(zhi)可以(yi)同時(shi)測(ce)幾(ji)十種(zhong)樣(yang)品(pin)。
如(ru)果(guo)是(shi)膜蛋(dan)白和胞(bao)漿蛋白(bai)，所(suo)用(yong)的去垢(gou)劑(ji)就(jiu)要(yao)溫和得(de)多(duo)，這(zhe)時(shi)加上(shang)NaF去抑制磷(lin)#化(hua)酶(mei)的活(huo)性(xing)。
樣品(pin)的蛋(dan)白(bai)含量很低(di)，每(mei)微(wei)升(sheng)不到(dao)微克(ke)，但是(shi)在轉膜時(shi)經常會(hui)發(fa)現(xian)只(zhi)有壹(yi)部(bu)分蛋(dan)白轉到(dao)了膜上(shang)，就(jiu)是(shi)在轉膜後(hou)染膠發(fa)現(xian)有的孔所(suo)有(you)的蛋(dan)白(bai)條帶(dai)都(dou)在，只(zhi)是(shi)顏色(se)變(bian)淡了，可以(yi)加大上(shang)樣(yang)量，轉移(yi)時(shi)可以(yi)用(yong)減少電(dian)流延(yan)長(chang)時(shi)間(jian)，多加5-0%甲醇(chun)。
想(xiang)分離的蛋(dan)白(bai)是(shi)分子(zi)量260kd的，SDS-PAGE電(dian)泳(yong)的分離膠濃(nong)度用6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的蛋(dan)白(bai)不好(hao)做(zuo)
如(ru)果(guo)上(shang)樣(yang)量超載(zai)，可以(yi)濃(nong)縮樣品(pin)，也(ye)可(ke)以(yi)根據(ju)妳(ni)的目(mu)標分子(zi)量透析掉壹(yi)部(bu)分小分子(zi)蛋白(bai)。壹(yi)般(ban)地，超載(zai)30%是(shi)不會(hui)有(you)問題的。如(ru)果(guo)已經(jing)超了不少(shao)了(le)，而且(qie)小分子(zi)量的也(ye)要(yao)，可(ke)以(yi)考(kao)慮加大膠的厚(hou)度，可以(yi)試(shi)試.5mm的 comb。
蛋(dan)白(bai)變(bian)性(xing)後存放-80℃，壹(yi)兩年(nian)沒(mei)有(you)問題，zui關(guan)鍵(jian)兩(liang)條(tiao)：不要(yao)被(bei)蛋(dan)白酶(mei)水解(jie)掉;不要(yao)被(bei)細(xi)菌消(xiao)化(hua)掉（也(ye)是(shi)被(bei)酶(mei)水解(jie)了）。
采用DAB顯色(se)技(ji)術，二抗(kang)是(shi)化(hua)的多(duo)克(ke)隆抗(kang)體(ti)，三抗(kang)是(shi)親(qin)和素(su)體(ti)系，不能使用(yong)脫脂奶粉，脫脂奶粉會(hui)影響親(qin)和素(su)的生成(cheng)，因為(wei)脫脂奶粉中(zhong)含，用(yong)BSA代(dai)替應該(gai)好(hao)壹(yi)點.
Western Blot壹般上(shang)樣(yang)30-00微(wei)克(ke)不等(deng)，結(jie)果(guo)跟目(mu)的蛋(dan)白(bai)的豐度、上(shang)樣(yang)量、壹二抗(kang)的量和撫育(yu)時(shi)間(jian)都(dou)有(you)關(guan)系(xi)，也(ye)與(yu)顯(xian)色(se)時(shi)間(jian)長(chang)短(duan)有(you)關(guan)。開始(shi)摸(mo)條件(jian)時(shi)，為了拿(na)到(dao)陽(yang)性(xing)結果(guo)，各個步(bu)驟(zhou)都(dou)可(ke)以(yi)量多壹(yi)點時(shi)間(jian)長(chang)壹點，當然背(bei)景也(ye)就(jiu)出(chu)來了。要拿(na)到(dao)好(hao)的結(jie)果(guo)，如果(guo)抗(kang)體(ti)好(hao)的話(hua)比(bi)較容(rong)易(yi)，抗(kang)體(ti)不好(hao)的話(hua)就(jiu)需(xu)要反復地(di)試(shi)了(le)，當然有的不適(shi)合(he)Western Blot的怎(zen)樣(yang)做(zuo)也(ye)不行(xing)。所(suo)以(yi)拿(na)到(dao)好(hao)的結(jie)果(guo)不容(rong)易(yi)。