【概(gai)要描述(shu)】兔(tu)抗(kang)人(ren)甲胎(tai)蛋(dan)白(bai)多克隆抗(kang)體 AFP Western免(mian)疫印(yin)跡(ji)(Western Blot)是將蛋(dan)白(bai)質轉移(yi)到(dao)膜(mo)上(shang)，然後(hou)利(li)用抗(kang)體進行檢測(ce)。

兔抗人(ren)甲胎(tai)蛋(dan)白(bai)多克隆抗(kang)體 AFP  Western Blot技術(shu): 做(zuo)線(xian)粒(li)體膜(mo)UCP2蛋白(bai)的Western Blot （以下簡寫成(cheng)Western Blot），提(ti)取(qu)線(xian)粒(li)體後凍(dong)存(cun)（未加(jia)蛋白(bai)酶抑制劑），樣品不(bu)能反(fan)復凍(dong)融;，加蛋(dan)白(bai)酶抑制劑。同時(shi)，建(jian)議(yi)檢查(zha)Western Blot過程(cheng)， 提高壹抗濃(nong)度。對於(yu)加(jia)蛋白(bai)酶抑制劑來說，壹(yi)般(ban)加(jia)PMSF就(jiu)可以了，能多加幾中種蛋白(bai)酶抑制劑。
同壹蛋(dan)白(bai)樣品能同(tong)時(shi)進(jin)行兩(liang)種因(yin)子的Western Blot檢測(ce)，有的甚至(zhi)可以同時(shi)測(ce)幾十(shi)種(zhong)樣品。
 兔(tu)抗人(ren)甲胎(tai)蛋(dan)白(bai)多克隆抗(kang)體 AFP如(ru)果(guo)是膜(mo)蛋白(bai)和胞漿(jiang)蛋(dan)白(bai)，所用的去垢(gou)劑(ji)就(jiu)要溫和得(de)多，這時(shi)加(jia)上(shang)NaF去抑制磷(lin)#化(hua)酶的活(huo)性。
樣(yang)品的蛋白(bai)含量(liang)很低(di)，每微(wei)升(sheng)不(bu)到(dao)微(wei)克(ke)，但(dan)是在轉膜(mo)時(shi)經(jing)常會(hui)發(fa)現(xian)只(zhi)有壹(yi)部分蛋白(bai)轉到(dao)了(le)膜(mo)上(shang)，就(jiu)是在轉膜(mo)後染膠(jiao)發(fa)現(xian)有(you)的孔所(suo)有(you)的蛋白(bai)條(tiao)帶都在，只(zhi)是顏(yan)色(se)變淡(dan)了，可以加大上(shang)樣量(liang)，轉移(yi)時(shi)可以用減(jian)少電流(liu)延長(chang)時(shi)間(jian)，多加5-0%甲醇。
想(xiang)分離的蛋白(bai)是分子量(liang)260kd的，SDS-PAGE電泳(yong)的分離膠(jiao)濃(nong)度用6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的蛋白(bai)不(bu)好(hao)做
如(ru)果(guo)上(shang)樣量(liang)超載(zai)，可以濃縮(suo)樣品，也(ye)可以根(gen)據妳的目標(biao)分子量(liang)透析(xi)掉(diao)壹部分小分子蛋(dan)白(bai)。壹般(ban)地，超載(zai)30%是不(bu)會(hui)有問(wen)題(ti)的。如(ru)果(guo)已(yi)經(jing)超(chao)了(le)不(bu)少了(le)，而(er)且(qie)小分子量(liang)的也要，可以考慮加(jia)大膠(jiao)的厚度，可以試試(shi).5mm的 comb。
蛋白(bai)變性(xing)後(hou)存(cun)放-80℃，壹(yi)兩(liang)年(nian)沒(mei)有(you)問題(ti)，zui關鍵兩(liang)條(tiao)：不(bu)要被蛋白(bai)酶水解掉(diao);不(bu)要被細菌消(xiao)化掉(diao)（也是被酶水解了）。
采用DAB顯(xian)色(se)技術(shu)，二抗(kang)是化的多克隆抗(kang)體，三抗(kang)是親(qin)和素(su)體系，不(bu)能使(shi)用脫(tuo)脂奶(nai)粉，脫(tuo)脂奶(nai)粉會(hui)影(ying)響(xiang)親(qin)和素(su)的生成，因(yin)為脫(tuo)脂奶(nai)粉中含，用BSA代(dai)替(ti)應(ying)該好(hao)壹點(dian).  兔抗(kang)人(ren)甲胎(tai)蛋(dan)白(bai)多克隆抗(kang)體 AFP  Western Blot壹般(ban)上(shang)樣30-00微(wei)克(ke)不(bu)等(deng)，結果(guo)跟(gen)目的蛋白(bai)的豐度、上(shang)樣量(liang)、壹二(er)抗(kang)的量(liang)和撫育(yu)時(shi)間(jian)都有(you)關系，也(ye)與(yu)顯(xian)色(se)時(shi)間(jian)長(chang)短(duan)有關。開始摸(mo)條(tiao)件時(shi)，為(wei)了(le)拿(na)到(dao)陽性結果(guo)，各(ge)個(ge)步驟(zhou)都可以量(liang)多壹點(dian)時(shi)間(jian)長(chang)壹(yi)點(dian)，當然背景也(ye)就(jiu)出來(lai)了。要拿到(dao)好(hao)的結果(guo)，如(ru)果(guo)抗體好(hao)的話比(bi)較(jiao)容(rong)易(yi)，抗體不(bu)好(hao)的話就(jiu)需要反(fan)復地試了，當然有(you)的不(bu)適(shi)合Western Blot的怎樣(yang)做(zuo)也不(bu)行。所以拿到(dao)好(hao)的結果(guo)不(bu)容(rong)易(yi)。

壹、 原(yuan)理

與Southern或(huo)Northern雜交(jiao)方(fang)法(fa)類(lei)似(si)，但(dan)Western Blot采用的是聚(ju)丙烯酰(xian)胺凝(ning)膠(jiao)電泳(yong)，被檢測(ce)物(wu)是蛋白(bai)質，“探針(zhen)”是抗體，“顯色(se)”用標(biao)記(ji)的二抗(kang)。經(jing)過PAGE分離的蛋白(bai)質樣(yang)品，轉移(yi)到(dao)固相(xiang)載(zai)體（例(li)如(ru)硝(xiao)#纖維素(su)薄膜(mo)）上(shang)，固相(xiang)載(zai)體以非(fei)共(gong)價鍵形式吸附(fu)蛋白(bai)質，且(qie)能保持(chi)電泳(yong)分離的多肽類(lei)型(xing)及(ji)其生物(wu)學活(huo)性不(bu)變(bian)。以固相(xiang)載(zai)體上(shang)的蛋白(bai)質或(huo)多肽作(zuo)為抗原(yuan)，與對應(ying)的抗體起免(mian)疫反(fan)應，再(zai)與酶或(huo)同(tong)位素(su)標(biao)記(ji)的第二(er)抗(kang)體起反(fan)應，經(jing)過底物(wu)顯色(se)或(huo)放(fang)射自(zi)顯(xian)影(ying)以檢測(ce)電泳(yong)分離的特異(yi)性(xing)目(mu)的基因(yin)表(biao)達的蛋白(bai)成分。該技術(shu)也廣(guang)泛(fan)應用於(yu)檢(jian)測(ce)蛋白(bai)水平(ping)的表(biao)達。

二、分類(lei) 兔抗(kang)人(ren)甲胎(tai)蛋(dan)白(bai)多克隆抗(kang)體 AFP  現(xian)常用的有底(di)物(wu)化學(xue)發(fa)光(guang)ECL和底物(wu)DAB呈色(se)，體同水平(ping)和實(shi)驗(yan)條(tiao)件的是用*種(zhong)方(fang)法(fa)，目(mu)前發(fa)表(biao)文(wen)章(zhang)通(tong)常是用底(di)物(wu)化學(xue)發(fa)光(guang)ECL。只(zhi)要買(mai)現(xian)成(cheng)的試劑(ji)盒(he)就(jiu)行，操作(zuo)也比(bi)較(jiao)簡單，原(yuan)理如(ru)下(xia)（二抗(kang)用HRP標記(ji)）：反(fan)應底(di)物(wu)為過氧(yang)化(hua)物(wu)+魯米諾(nuo)，如(ru)遇(yu)到(dao)HRP，即發(fa)光(guang)，可使(shi)膠(jiao)片曝光(guang)，就(jiu)可洗(xi)出(chu)條(tiao)帶。

三、 主要試劑

、 丙烯酰(xian)胺和N，N’-亞甲雙丙(bing)烯酰(xian)胺，應(ying)以溫熱(re)（以利(li)於溶(rong)解雙丙(bing)稀酰(xian)胺）的去離子(zi)水配制含有(you)29%（w/v）丙稀(xi)酰(xian)胺和%（w/v）N，N’-亞甲雙丙(bing)烯酰(xian)胺儲(chu)存(cun)液丙(bing)稀酰(xian)胺29g，N，N-亞甲叉雙丙(bing)稀酰(xian)胺g，加H2O至(zhi) 00ml。）儲於(yu)棕(zong)色(se)瓶，4℃避光(guang)保存(cun)。嚴格(ge)核實(shi)PH不(bu)得(de)超過7.0，因(yin)可以發(fa)生脫(tuo)氨基(ji)反(fan)應是光(guang)催化或(huo)堿(jian)催化的。使用期(qi)不(bu)得(de)超過兩(liang)個(ge)月，隔(ge)幾個(ge)月須(xu)重(zhong)新配制。如(ru)有(you)沈(chen)澱(dian)，可以過濾。  兔(tu)抗(kang)人(ren)甲胎(tai)蛋(dan)白(bai)多克隆抗(kang)體 AFP2、 十二(er)烷(wan)基(ji)硫(liu)#鈉(na)SDS溶液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離子(zi)水配制，室(shi)溫保存(cun)。

3、 分離膠(jiao)緩沖(chong)液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合，加(jia)水稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終體積。過濾後(hou)40℃保存(cun)。

4、 濃縮(suo)膠(jiao)緩沖(chong)液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於(yu)40mlH2O中，用約(yue)48ml mol/L HCl調至(zhi)pH6.8加水稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終體積。過濾後(hou)40C保存(cun)。這兩(liang)種緩沖(chong)液(ye)必(bi)須(xu)使(shi)用Tris堿(jian)制備(bei)，再用HCL調節(jie)PH值，而不(bu)用 Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶液N，N，N’N’四甲(jia)基乙(yi)二(er)胺催化過硫(liu)#銨形成自(zi)由(you)基(ji)而(er)加速兩(liang)種丙(bing)稀酰(xian)胺的聚(ju)合。PH太低(di)時(shi)，聚(ju)合反(fan)應受(shou)到(dao)抑制。0%（w/v）過硫(liu)#胺溶(rong)液(ye)。提供(gong)兩(liang)種丙(bing)稀酰(xian)胺聚(ju)合所(suo)必須(xu)的自(zi)由(you)基(ji)。去離子(zi)水配制數ml，臨用前配制.

6、 SDS- PAGE加樣(yang)緩沖(chong)液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖(chong)液(ye)8ml，甘油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴酚(fen)藍(lan).6ml，H2O 32ml混勻(yun)備(bei)用。按(an):或(huo):2比(bi)例(li)與(yu)蛋(dan)白(bai)質樣(yang)品混合，在沸水終(zhong)煮3min混勻(yun)後再(zai)上(shang)樣，壹(yi)般(ban)為(wei)20-25ul，總蛋(dan)白(bai)量(liang)00μg。

7、 Tris-甘氨#電泳(yong)緩沖(chong)液(ye):30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用蒸餾水溶(rong)解至(zhi)000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極緩沖(chong)液(ye)。臨用前稀釋(shi)0倍。

8、 轉移(yi)緩沖(chong)液(ye)：配制L轉移(yi)緩沖(chong)液(ye)，需(xu)稱取(qu)2.9g甘氨#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並加入200ml甲醇，加水至(zhi)總量(liang)L。

9、 麗春(chun)紅(hong)染液儲(chu)存(cun)液：麗(li)春紅(hong)S 2g 三#乙(yi)#30g 磺基(ji)水楊# 30g 加水至(zhi)00ml 用時(shi)上(shang)述(shu)儲(chu)存(cun)液稀(xi)釋0倍即成麗春紅(hong)S使用液(ye)。使(shi)用後(hou)應(ying)予(yu)以廢棄。

0、 脫(tuo)脂奶(nai)粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉(na)（有毒，戴手(shou)套操作(zuo)），溶於(yu)磷(lin)#緩沖(chong)鹽(yan)溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖(chong)鹽(yan)溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗(kang)人(ren)-MMP-9（6）鼠抗(kang)人(ren)-TIMP-。

4、 過氧(yang)化(hua)物(wu)酶標(biao)記(ji)的第二(er)抗(kang)體。

5、 NBT（溶於(yu)70%二甲(jia)基(ji)甲酰(xian)胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於(yu)00%二甲(jia)基(ji)甲酰(xian)胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。