【概(gai)要描(miao)述】兔抗 a鏈(lian)多(duo)克隆抗體(ti) a-Human Chorionic Gonadotropin (hCG) Western Blot)是將蛋白(bai)質(zhi)轉(zhuan)移(yi)到(dao)膜(mo)上(shang)，然後(hou)利(li)用抗體(ti)進(jin)行(xing)檢(jian)測(ce)。

兔抗 a鏈(lian)多(duo)克隆抗體(ti) a-Human Chorionic Gonadotropin （hCG）   Western Blot技(ji)術(shu):

壹、 原理(li)

與(yu)Southern或(huo)Northern雜交(jiao)方法(fa)類(lei)似，但(dan)Western Blot采用(yong)的是聚丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺凝膠電(dian)泳，被(bei)檢測(ce)物是蛋白(bai)質(zhi)，“探針(zhen)”是抗體(ti)，“顯色”用標記的(de)二(er)抗。經過(guo)PAGE分離(li)的蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣(yang)品(pin)，轉(zhuan)移(yi)到(dao)固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)（例如(ru)硝#纖維素薄膜(mo)）上(shang)，固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)以非(fei)共價(jia)鍵(jian)形式吸附蛋白(bai)質(zhi)，且(qie)能(neng)保持電(dian)泳分離(li)的多(duo)肽(tai)類(lei)型(xing)及(ji)其(qi)生(sheng)物(wu)學活(huo)性(xing)不變。以(yi)固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)上(shang)的蛋(dan)白(bai)質(zhi)或(huo)多(duo)肽(tai)作(zuo)為抗原，與(yu)對應(ying)的抗體(ti)起免(mian)疫反應，再(zai)與(yu)酶或(huo)同(tong)位(wei)素標記的(de)第(di)二抗體(ti)起反應，經(jing)過(guo)底(di)物顯色或(huo)放(fang)射(she)自(zi)顯影以檢測(ce)電(dian)泳分離(li)的特(te)異性(xing)目的基(ji)因(yin)表(biao)達(da)的(de)蛋(dan)白(bai)成分。該(gai)技(ji)術(shu)也(ye)廣泛(fan)應(ying)用於(yu)檢測(ce)蛋白(bai)水平的(de)表(biao)達(da)。

二(er)、分類(lei)兔抗 a鏈(lian)多(duo)克隆抗體(ti) a-Human Chorionic Gonadotropin （hCG）  現(xian)常用(yong)的有(you)底物(wu)化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)ECL和(he)底物DAB呈(cheng)色，體(ti)同水平和(he)實驗條件的(de)是用*種方法(fa)，目前發(fa)表(biao)文(wen)章通常是用底(di)物(wu)化(hua)學發(fa)光(guang)ECL。只要買現(xian)成的(de)試劑盒(he)就(jiu)行(xing)，操作(zuo)也(ye)比(bi)較(jiao)簡單(dan)，原理(li)如(ru)下(xia)（二抗用HRP標記）：反應底(di)物為過(guo)氧化物(wu)+魯米諾(nuo)，如(ru)遇到(dao)HRP，即(ji)發(fa)光(guang)，可(ke)使(shi)膠片曝光(guang)，就(jiu)可(ke)洗(xi)出(chu)條帶(dai)。

三、 主(zhu)要試劑

、 丙烯(xi)酰(xian)胺和(he)N，N’-亞甲(jia)雙丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺，應以溫熱（以利(li)於(yu)溶解(jie)雙丙(bing)稀酰胺）的去(qu)離子(zi)水配(pei)制含(han)有(you)29%（w/v）丙稀(xi)酰胺和(he)%（w/v）N，N’-亞甲(jia)雙丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺儲(chu)存(cun)液(ye)丙稀(xi)酰胺29g，N，N-亞甲(jia)叉(cha)雙(shuang)丙稀(xi)酰胺g，加H2O至 00ml。）儲(chu)於(yu)棕色瓶，4℃避(bi)光(guang)保存(cun)。嚴格核實PH不得(de)超(chao)過(guo)7.0，因可(ke)以發(fa)生(sheng)脫(tuo)氨(an)基反應是光(guang)催(cui)化(hua)或(huo)堿(jian)催(cui)化(hua)的(de)。使(shi)用(yong)期不得超(chao)過(guo)兩(liang)個月，隔幾個月須重(zhong)新(xin)配(pei)制。如(ru)有(you)沈(chen)澱(dian)，可(ke)以過(guo)濾(lv)。 a-Human Chorionic Gonadotropin （hCG）  2、 十二(er)烷基(ji)硫#鈉SDS溶液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離(li)子水配(pei)制，室(shi)溫保存(cun)。

3、 分離(li)膠緩(huan)沖液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混(hun)合，加水稀釋(shi)到(dao)00ml終(zhong)體(ti)積。過(guo)濾(lv)後(hou)40℃保存(cun)。

4、 濃(nong)縮(suo)膠緩(huan)沖液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於(yu)40mlH2O中(zhong)，用約48ml mol/L HCl調至pH6.8加水稀釋(shi)到(dao)00ml終(zhong)體(ti)積。過(guo)濾(lv)後(hou)40C保存(cun)。這(zhe)兩(liang)種緩(huan)沖(chong)液(ye)必(bi)須使(shi)用(yong)Tris堿制(zhi)備，再(zai)用(yong)HCL調節(jie)PH值，而不(bu)用 Tris.CL。

5、 TEMED原溶液(ye)N，N，N’N’四甲(jia)基乙(yi)二胺催(cui)化(hua)過(guo)硫(liu)#銨形(xing)成自(zi)由基(ji)而(er)加速兩(liang)種丙(bing)稀(xi)酰(xian)胺的聚合。PH太低時，聚合反應受(shou)到(dao)抑制。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺溶液(ye)。提(ti)供兩(liang)種丙(bing)稀(xi)酰(xian)胺聚合所必(bi)須的(de)自(zi)由基(ji)。去(qu)離(li)子水配(pei)制數ml，臨(lin)用前配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加樣緩(huan)沖液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖(chong)液8ml，甘(gan)油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚藍(lan).6ml，H2O 32ml混(hun)勻備用(yong)。按:或(huo):2比(bi)例(li)與(yu)蛋白(bai)質(zhi)樣(yang)品(pin)混(hun)合，在沸水終(zhong)煮(zhu)3min混(hun)勻後(hou)再(zai)上(shang)樣，壹般(ban)為20-25ul，總蛋(dan)白(bai)量(liang)00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨(an)#電(dian)泳緩(huan)沖液:30.3gTris，88g甘(gan)氨(an)#，0gSDS，用蒸(zheng)餾(liu)水溶解(jie)至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨(an)#電(dian)極緩(huan)沖液。臨(lin)用前稀(xi)釋0倍。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩沖液(ye)：配(pei)制L轉(zhuan)移(yi)緩沖液(ye)，需(xu)稱取(qu)2.9g甘(gan)氨(an)#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並加入200ml甲醇(chun)，加水至總(zong)量L。

9、 麗(li)春紅(hong)染液儲(chu)存(cun)液(ye)：麗(li)春紅(hong)S 2g 三#乙(yi)#30g 磺基水楊# 30g 加水至00ml 用時(shi)上(shang)述儲(chu)存(cun)液(ye)稀釋(shi)0倍即(ji)成麗(li)春紅(hong)S使用(yong)液。使(shi)用後(hou)應予(yu)以廢棄。

0、 脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮(dan)鈉（有(you)毒，戴手(shou)套(tao)操作(zuo)），溶於(yu)磷#緩沖(chong)鹽溶液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖(chong)鹽溶液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗人(ren)-MMP-9（6）鼠抗人(ren)-TIMP-。

4、 過(guo)氧化物(wu)酶標記的(de)第(di)二抗體(ti)。

5、 NBT（溶於(yu)70%二甲(jia)基甲(jia)酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於(yu)00%二甲(jia)基甲(jia)酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA a-Human Chorionic Gonadotropin （hCG）  做(zuo)線粒(li)體(ti)膜(mo)UCP2蛋白(bai)的(de)Western Blot （以(yi)下(xia)簡寫(xie)成Western Blot），提(ti)取線(xian)粒體(ti)後(hou)凍存(cun)（未(wei)加蛋白(bai)酶抑(yi)制劑），樣品不(bu)能(neng)反復(fu)凍融;，加蛋白(bai)酶抑(yi)制劑。同時，建議(yi)檢(jian)查Western Blot過(guo)程(cheng)， 提(ti)高(gao)壹抗濃(nong)度。對於(yu)加蛋白(bai)酶抑(yi)制劑來說，壹般(ban)加PMSF就可(ke)以了，能(neng)多加幾中(zhong)種蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制劑。
同壹蛋白(bai)樣(yang)品(pin)能(neng)同時進(jin)行(xing)兩(liang)種因(yin)子(zi)的(de)Western Blot檢(jian)測(ce)，有(you)的甚(shen)至可(ke)以同(tong)時(shi)測(ce)幾十(shi)種樣(yang)品(pin)。
如(ru)果是膜(mo)蛋白(bai)和(he)胞漿(jiang)蛋白(bai)，所(suo)用(yong)的(de)去(qu)垢(gou)劑就(jiu)要溫和(he)得多，這(zhe)時(shi)加上(shang)NaF去抑(yi)制(zhi)磷(lin)#化酶的(de)活(huo)性(xing)。
樣品的(de)蛋(dan)白(bai)含(han)量(liang)很(hen)低(di)，每微(wei)升(sheng)不到(dao)微(wei)克，但(dan)是在轉(zhuan)膜(mo)時經常會(hui)發(fa)現(xian)只有(you)壹部分蛋(dan)白(bai)轉(zhuan)到(dao)了膜(mo)上(shang)，就是在轉(zhuan)膜(mo)後(hou)染膠發(fa)現(xian)有(you)的孔(kong)所(suo)有(you)的蛋(dan)白(bai)條(tiao)帶(dai)都在(zai)，只(zhi)是顏色變(bian)淡了，可(ke)以(yi)加大(da)上(shang)樣量(liang)，轉(zhuan)移(yi)時可以(yi)用(yong)減(jian)少電(dian)流(liu)延長時(shi)間(jian)，多加5-0%甲醇(chun)。
想分離(li)的蛋(dan)白(bai)是分子(zi)量260kd的(de)，SDS-PAGE電(dian)泳的(de)分離(li)膠濃(nong)度用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的(de)蛋(dan)白(bai)不(bu)好(hao)做(zuo)
如(ru)果上(shang)樣量(liang)超(chao)載(zai)，可以(yi)濃(nong)縮(suo)樣品(pin)，也(ye)可以(yi)根據(ju)妳(ni)的(de)目標分子(zi)量透(tou)析(xi)掉壹部分小(xiao)分子(zi)蛋白(bai)。壹般(ban)地，超(chao)載(zai)30%是不會(hui)有(you)問題(ti)的(de)。如(ru)果已(yi)經超(chao)了不(bu)少了，而(er)且(qie)小(xiao)分子(zi)量的(de)也(ye)要，可以考(kao)慮(lv)加大(da)膠的(de)厚(hou)度(du)，可(ke)以(yi)試試.5mm的 comb。
蛋(dan)白(bai)變(bian)性(xing)後(hou)存(cun)放(fang)-80℃，壹兩年(nian)沒(mei)有(you)問題(ti)，zui關(guan)鍵兩(liang)條：不要被蛋白(bai)酶水解(jie)掉;不(bu)要被細菌消(xiao)化掉(diao)（也(ye)是被酶水解(jie)了）。
采(cai)用(yong)DAB顯色技(ji)術(shu)，二(er)抗是化的(de)多(duo)克隆抗體(ti)，三抗是親和(he)素體(ti)系，不(bu)能(neng)使用脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉，脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉會影(ying)響(xiang)親和(he)素的生(sheng)成，因(yin)為脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉中(zhong)含，用(yong)BSA代替應(ying)該(gai)好(hao)壹點.
Western Blot壹般(ban)上(shang)樣30-00微(wei)克不等(deng)，結(jie)果跟(gen)目的蛋(dan)白(bai)的(de)豐(feng)度、上(shang)樣量(liang)、壹二抗的量(liang)和(he)撫育時(shi)間(jian)都有(you)關(guan)系，也(ye)與(yu)顯色時(shi)間(jian)長短有(you)關(guan)。開(kai)始(shi)摸(mo)條件(jian)時，為了拿(na)到(dao)陽性(xing)結(jie)果，各(ge)個步(bu)驟(zhou)都(dou)可(ke)以量多壹點時(shi)間(jian)長壹點，當(dang)然背(bei)景也(ye)就出(chu)來了。要拿到(dao)好(hao)的(de)結(jie)果，如(ru)果抗體(ti)好(hao)的(de)話比(bi)較(jiao)容易，抗體(ti)不好(hao)的(de)話就需(xu)要反復(fu)地(di)試了，當(dang)然有(you)的不(bu)適合Western Blot的怎樣做(zuo)也(ye)不行(xing)。所以拿到(dao)好(hao)的(de)結(jie)果不(bu)容易。