【概要描(miao)述(shu)】兔腦靜(jing)脈(mai)血(xue)管內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)的(de)相(xiang)關產(chan)品(pin)：LX-2/RFP (STR)人(ren)肝(gan)星(xing)形(xing)細(xi)胞(bao)人(ren)原代(dai)主動(dong)脈(mai)內皮(pi)細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)原代(dai)垂體(ti)細(xi)胞(bao)兔原代(dai)室管膜(mo)細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)原代(dai)肝星(xing)狀(zhuang)細(xi)胞(bao)人(ren)原代(dai)羊水幹(gan)細(xi)胞(bao)大(da)鼠(shu)原代(dai)上皮(pi)細(xi)胞(bao)兔原代(dai)DRG神經元細(xi)胞(bao)人(ren)原代(dai)肺動(dong)脈(mai)高壓血(xue)管內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)人(ren)原代(dai)乳腺癌(ai)相(xiang)關成纖維(wei)細(xi)胞(bao)

兔腦靜(jing)脈(mai)血(xue)管內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)

包(bao)被(bei)條(tiao)件(jian) PLL（0.1mg/ml），明(ming)膠（0.1%）

培(pei)養基(ji) 含(han)FBS、生(sheng)長(chang)添(tian)加劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液(ye)頻率 每2-3天(tian)換液(ye)壹次

生(sheng)長(chang)特性(xing) 貼(tie)壁

細(xi)胞(bao)形(xing)態(tai) 內(nei)皮細(xi)胞(bao)樣(yang)

傳(chuan)代(dai)特性(xing) 可(ke)傳1-3代(dai)

消(xiao)化(hua)液(ye) 0.25%yi蛋白酶

培(pei)養條(tiao)件 氣(qi)相：空氣(qi)，95%；CO2，5%

兔腦靜(jing)脈(mai)血(xue)管內(nei)皮(pi)分(fen)離(li)自腦(nao)靜(jing)脈(mai)組織；與(yu)腦動(dong)脈(mai)相比，腦靜(jing)脈(mai)管壁(bi)較(jiao)薄(bo)。與(yu)身(shen)體(ti)其(qi)他部位(wei)的(de)靜(jing)脈(mai)不同(tong)，腦靜(jing)脈(mai)管壁(bi)中沒(mei)有(you)靜(jing)脈(mai)瓣，靜(jing)脈(mai)血(xue)的(de)回流(liu)依(yi)賴(lai)高位(wei)的(de)勢能。腦靜(jing)脈(mai)血(xue)的(de)回流(liu)路(lu)徑可以(yi)歸(gui)納為(wei)：大(da)部(bu)腦靜(jing)脈(mai)血(xue)經腦深部靜(jing)脈(mai)和腦(nao)血(xue)竇(dou)流入(ru)頸(jing)內(nei)靜(jing)脈(mai)醫|學教育(yu)網搜(sou)集(ji)整理(li)；小(xiao)部腦(nao)靜(jing)脈(mai)血(xue)經眼部翼狀(zhuang)靜(jing)脈(mai)叢(cong)，進入(ru)靜(jing)脈(mai)導(dao)血(xue)管再(zai)到頭(tou)皮(pi)，最(zui)後流入(ru)椎(zhui)管中的椎(zhui)旁(pang)靜(jing)脈(mai)系統。腦(nao)靜(jing)脈(mai)系統有(you)大(da)量交(jiao)通枝靜(jing)脈(mai)叢(cong)，即使(shi)兩側(ce)頸(jing)內(nei)靜(jing)脈(mai)都被(bei)阻(zu)塞(sai)，大(da)腦(nao)靜(jing)脈(mai)血(xue)仍(reng)可經椎靜(jing)脈(mai)和頸(jing)外(wai)靜(jing)脈(mai)系統完(wan)成其回(hui)流。腦(nao)靜(jing)脈(mai)血(xue)管內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)的(de)主(zhu)要功能是維(wei)持(chi)血(xue)管內(nei)外(wai)的動(dong)態平(ping)衡(heng)，合成和分(fen)泌細(xi)胞(bao)因(yin)子和(he)介(jie)質(zhi)參(can)與(yu)免疫反(fan)應(ying)，維(wei)持(chi)凝血(xue)和(he)纖溶(rong)的(de)動(dong)態平(ping)衡(heng)。
方(fang)法簡(jian)介(jie)：

公(gong)司實驗(yan)室分(fen)離(li)的兔腦靜(jing)脈(mai)血(xue)管內(nei)皮(pi)采用yi蛋白酶-膠(jiao)原酶(mei)聯合消化(hua)法結(jie)合差速(su)貼(tie)壁法、並(bing)通過內皮細(xi)胞(bao)專(zhuan)用培(pei)養基(ji)培(pei)養篩(shai)選制(zhi)備(bei)而來(lai)，細(xi)胞(bao)總(zong)量約(yue)為5×10?cells/瓶(ping)。
質(zhi)量檢測(ce)：

公(gong)司實驗(yan)室分(fen)離(li)的兔腦靜(jing)脈(mai)血(xue)管內(nei)皮(pi)經CD31免(mian)疫熒(ying)光鑒定(ding)，純(chun)度可(ke)達(da)90%以上，且不含(han)有(you)HIV-1、HBV、HCV、支原體(ti)、細(xi)菌(jun)、酵母(mu)和真(zhen)菌(jun)等(deng)。

壹(yi)、細(xi)胞(bao)培(pei)養

1取(qu)材 在無菌(jun)環(huan)境(jing)下從(cong)機(ji)體取(qu)出某種(zhong)組織細(xi)胞(bao)（視(shi)實驗(yan)目的(de)而定(ding)），經過壹定(ding)的(de)處(chu)理(li)（如(ru)消化(hua)分(fen)散細(xi)胞(bao)、分(fen)離(li)等(deng)）後接(jie)入培(pei)養器(qi)血(xue)中，這壹過程稱為(wei)取材。如(ru)是細(xi)胞(bao)株(zhu)的(de)擴(kuo)大(da)培(pei)養則無取材這壹過程。機(ji)體取(qu)出的組織細(xi)胞(bao)的(de)培(pei)養稱為(wei)原代(dai)培(pei)養。2培(pei)養 將(jiang)取得(de)的(de)組織細(xi)胞(bao)接(jie)入培(pei)養瓶(ping)或培(pei)養板中的過程稱為(wei)培(pei)養。3凍存(cun)及(ji)復(fu)蘇(su)（可(ke)參(can)閱後面(mian)有(you)關章節(jie)）為(wei)了(le)保(bao)存(cun)細(xi)胞(bao)，特別(bie)是(shi)不(bu)易獲得(de)的(de)突(tu)變(bian)型細(xi)胞(bao)或(huo)細(xi)胞(bao)株(zhu)，要將(jiang)細(xi)胞(bao)凍存(cun)。凍存(cun)的(de)溫(wen)度壹(yi)般(ban)用液(ye)氮(dan)的溫(wen)度－196℃，將(jiang)細(xi)胞(bao)收(shou)集(ji)至(zhi)凍存(cun)管中加入(ru)含(han)保(bao)護劑（壹(yi)般(ban)為二甲(jia)亞碸(feng)或(huo)甘(gan)油(you)）的(de)培(pei)養基(ji)，以(yi)壹(yi)定(ding)的(de)冷卻(que)速(su)度凍存(cun)，最(zui)終保(bao)存(cun)於(yu)液(ye)氮(dan)中。在極低的(de)溫度下，細(xi)胞(bao)保(bao)存(cun)的(de)時間(jian)幾(ji)乎是(shi)無限的(de)。復蘇(su)壹(yi)般采(cai)用快融(rong)方(fang)法，即(ji)從(cong)液(ye)氮(dan)中取出(chu)凍存(cun)管後，立即(ji)放入37℃水(shui)中，使之(zhi)在壹(yi)分(fen)鐘內(nei)迅(xun)速(su)融(rong)解(jie)。然(ran)後將(jiang)細(xi)胞(bao)轉(zhuan)入(ru)培(pei)養器(qi)皿(min)中進行培(pei)養。

二(er)、原代(dai)細(xi)胞(bao)分(fen)離(li)

凡(fan)是(shi)來(lai)源(yuan)於(yu)胚(pei)胎、組織器(qi)官及(ji)外(wai)周血(xue)，經特殊分(fen)離(li)方(fang)法制(zhi)備(bei)而來(lai)的(de)原初培(pei)養的(de)細(xi)胞(bao)稱之(zhi)為原代(dai)細(xi)胞(bao)。1懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞(bao)的(de)分(fen)離(li)方(fang)法組織材料若來(lai)自血(xue)液(ye)、羊水、胸(xiong)水(shui)或(huo)腹(fu)水(shui)的懸液(ye)材料，的(de)方(fang)法是(shi)采用1000r/min的低速(su)離(li)心10分(fen)鐘。經離(li)心後由於(yu)各(ge)種(zhong)細(xi)胞(bao)的(de)比重不同(tong)可在分(fen)層液(ye)中形(xing)成不同(tong)層，這樣(yang)可根(gen)據需要收獲目的細(xi)胞(bao)。2實體組織材料的(de)分(fen)離(li)方(fang)法對(dui)於實體組織材料，由(you)於(yu)細(xi)胞(bao)間(jian)結(jie)合緊(jin)密(mi)，為(wei)了(le)使(shi)組織中的細(xi)胞(bao)充(chong)分(fen)分(fen)散，形(xing)成細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)，可采(cai)用機(ji)械(xie)分(fen)散法（物理(li)裂(lie)解(jie)）和(he)消(xiao)化(hua)分(fen)離(li)法。

三(san)、細(xi)胞(bao)增殖檢測(ce)技(ji)術(shu)

目(mu)前主要有兩種(zhong)用於檢測(ce)細(xi)胞(bao)增殖能(neng)力的(de)方(fang)法。壹(yi)種(zhong)是(shi)直接(jie)的方(fang)法，通過直接(jie)測定(ding)進行分(fen)裂(lie)

的(de)細(xi)胞(bao)數(shu)來評(ping)價(jia)細(xi)胞(bao)的(de)增殖能(neng)力。另壹種(zhong)是(shi)間接(jie)的方(fang)法，即(ji)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)（cell viability）檢測(ce)方(fang)法，通過檢測(ce)樣(yang)品(pin)中健(jian)康細(xi)胞(bao)的(de)數(shu)目來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞(bao)的(de)增殖能(neng)力。顯(xian)然，細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢測(ce)法並(bing)不能(neng)最(zui)終證(zheng)明檢測(ce)樣(yang)品(pin)中的細(xi)胞(bao)是(shi)否(fou)在增殖。如(ru)細(xi)胞(bao)在某壹培(pei)養條(tiao)件下會(hui)自發(fa)啟(qi)動(dong)雕亡程序(xu)，但藥物的幹(gan)擾(rao)可(ke)抑(yi)制(zhi)雕(diao)亡的(de)發(fa)生(sheng)；這時若采(cai)用細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢測(ce)法，顯(xian)然可(ke)以(yi)區分(fen)兩種(zhong)條(tiao)件下的(de)細(xi)胞(bao)數(shu)量，但我們並(bing)不能(neng)從(cong)藥物幹(gan)擾(rao)組細(xi)胞(bao)數(shu)大(da)於(yu)對照(zhao)組的(de)事(shi)實說(shuo)明(ming)藥物可促進細(xi)胞(bao)增殖的(de)結論。所(suo)以(yi)最(zui)直接(jie)的證(zheng)據應(ying)該(gai)采(cai)用方(fang)法壹(yi)。

取(qu)材：首(shou)先(xian)，用培(pei)養液(ye)濕潤(run)所(suo)取(qu)的(de)組織材料，並(bing)用鋒(feng)利(li)的眼科(ke)剪(jian)去除(chu)附(fu)在其(qi)上(shang)的脂肪(fang)和(he)結締組織。接(jie)著(zhe)用平(ping)衡(heng)液(ye)（如(ru)PBS或Hanks液(ye)）漂洗(xi)，再(zai)用眼科(ke)彎剪(jian)將(jiang)組織塊(kuai)剪(jian)成小塊(kuai)。多(duo)次用PBS或Hanks液(ye)漂洗(xi)，直到(dao)液(ye)體清(qing)亮、無油滴(di)為止。

接(jie)種(zhong)：用濕潤(run)的吸管吸取(qu)切碎的(de)組織塊(kuai)，輕輕(qing)吹到(dao)培(pei)養瓶(ping)皿(min)中，並按壹定(ding)間(jian)距均勻放在培(pei)養瓶(ping)底壁(bi)上。註意不(bu)要過多(duo)，確保(bao)組織塊(kuai)切面(mian)貼(tie)在培(pei)養瓶(ping)底壁(bi)上。

培(pei)養：將(jiang)培(pei)養瓶(ping)翻轉(zhuan)，使(shi)瓶底(di)朝(chao)上，在種(zhong)植(zhi)了組織塊(kuai)壹側(ce)的對(dui)側(ce)面(mian)加足培(pei)養液(ye)，避免(mian)組織塊(kuai)與(yu)培(pei)養液(ye)接(jie)觸，然後塞緊(jin)瓶(ping)塞(sai)。將(jiang)種(zhong)植(zhi)了組織塊(kuai)的壹(yi)側(ce)朝上(shang)，靜(jing)置(zhi)於37℃培(pei)養箱(xiang)中。待組織塊(kuai)貼(tie)壁1到3小時後翻瓶(ping)，使(shi)貼(tie)壁的組織塊(kuai)浸(jin)沒(mei)在培(pei)養液(ye)中，繼續(xu)靜(jing)置(zhi)。換液(ye)：每隔2到(dao)3天(tian)更(geng)換壹(yi)次培(pei)養液(ye)，或者根據(ju)培(pei)養瓶(ping)種(zhong)顏(yan)色(se)的(de)變(bian)化(hua)確定(ding)換液(ye)時間(jian)。

壹(yi)、原代(dai)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)

將(jiang)血(xue)球(qiu)計(ji)數(shu)板及(ji)蓋(gai)片用擦試幹(gan)凈，並將(jiang)蓋片(pian)蓋在計(ji)數(shu)板上(shang)。

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)吸出(chu)少(shao)許(xu)，滴(di)加在蓋(gai)片(pian)邊緣，使(shi)懸液(ye)充(chong)滿蓋(gai)片(pian)和計(ji)數(shu)板之(zhi)間(jian)。

靜(jing)置(zhi)3分(fen)鐘。

鏡(jing)下觀(guan)察(cha)，計(ji)算(suan)計(ji)數(shu)板四(si)大(da)格(ge)細(xi)胞(bao)總(zong)數(shu)，壓線(xian)細(xi)胞(bao)只計(ji)左(zuo)側(ce)和上(shang)方(fang)的。然(ran)後按下式計(ji)算(suan)：

細(xi)胞(bao)數(shu)/ml＝4大(da)格(ge)細(xi)胞(bao)總(zong)數(shu)/ 4×10000

註(zhu)意：鏡(jing)下偶見(jian)由(you)兩(liang)個(ge)以上細(xi)胞(bao)組成的細(xi)胞(bao)團(tuan)，應(ying)按單(dan)個(ge)細(xi)胞(bao)計(ji)算(suan)，若細(xi)胞(bao)團(tuan)占(zhan)10%以(yi)上，說(shuo)明(ming)分(fen)散不(bu)好，需重新制(zhi)備(bei)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)。

二(er)、原代(dai)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)以0.5ml加入(ru)試(shi)管中。

加入(ru)0.5ml 0.4%臺盼蘭(lan)染液(ye)，染色(se)2壹(yi)3分(fen)鐘。

吸取(qu)少(shao)許(xu)懸(xuan)液(ye)塗於載玻(bo)片上(shang)，加上(shang)蓋(gai)片。

鏡(jing)下取(qu)幾個(ge)任意視(shi)野分(fen)別計(ji)死(si)細(xi)胞(bao)和(he)活(huo)細(xi)胞(bao)數(shu)，計(ji)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)。

死(si)細(xi)胞(bao)能(neng)被(bei)臺盼蘭(lan)染上(shang)色(se)，鏡(jing)下可(ke)見(jian)深蘭(lan)色(se)的(de)細(xi)胞(bao)，活(huo)細(xi)胞(bao)不(bu)被(bei)染(ran)色(se)，鏡(jing)下呈無色(se)透明(ming)狀(zhuang)。

活(huo)力測定(ding)可(ke)以和(he)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)合起來進行，但要考(kao)慮到染(ran)液(ye)對原細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)的加倍(bei)稀(xi)釋作(zuo)用。