【概要(yao)描(miao)述】兔外周(zhou)血白細胞(bao)的相關(guan)產(chan)品：93T449人高分化(hua)脂肪(fang)肉(rou)瘤細(xi)胞(bao)小鼠原(yuan)代皮膚(fu)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞小(xiao)鼠原(yuan)代食管平(ping)滑肌細胞人類(lei)風(feng)濕(shi)關(guan)節(jie)炎患(huan)者(zhe)軟骨(gu)細胞(bao)小(xiao)鼠原(yuan)代主(zhu)動脈平滑肌細胞清(qing)道(dao)夫(fu)魚魚唇(chun)表皮細胞(bao)大(da)鼠原(yuan)代結腸(chang)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞兔原(yuan)代內皮(pi)祖(zu)細(xi)胞(bao)大(da)鼠原(yuan)代腎動脈平滑肌細胞兔原(yuan)代胰(yi)島細(xi)胞(bao)

兔外周(zhou)血白細胞(bao)

培(pei)養(yang)基 含(han)FBS、生(sheng)長添(tian)加(jia)劑、Penicillin、Streptomycin等

換(huan)液頻率 每2-3天(tian)換(huan)液壹(yi)次(ci)

生(sheng)長特(te)性 懸(xuan)浮

細(xi)胞(bao)形態 圓(yuan)形

傳(chuan)代特性(xing) 不(bu)增(zeng)殖；不(bu)傳(chuan)代

消(xiao)化(hua)液 0.25%yi蛋(dan)白酶

培(pei)養(yang)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔外周(zhou)血白體外(wai)培(pei)養(yang)周(zhou)期有(you)限；建(jian)議(yi)使(shi)用公(gong)司(si)

兔外周(zhou)血白分離(li)自外周(zhou)血；外(wai)周(zhou)血是(shi)除骨(gu)髓之(zhi)外(wai)的(de)血(xue)液，臨床上常(chang)用壹(yi)些(xie)方(fang)法把(ba)骨(gu)髓中(zhong)的(de)造血幹(gan)細(xi)胞(bao)釋(shi)放到血液中(zhong)，再在從血(xue)液中(zhong)提取(qu)分離(li)得到造血幹(gan)細(xi)胞(bao)，我們把(ba)這樣(yang)得到的(de)幹(gan)細(xi)胞(bao)稱(cheng)為外(wai)周(zhou)血幹(gan)細(xi)胞(bao)，在二十壹世紀初(chu)人類(lei)開(kai)始的(de)生(sheng)命方舟計(ji)劃中(zhong)提出外周(zhou)血這壹(yi)新(xin)概(gai)念(nian)。白細胞(bao)是(shi)壹類(lei)無色(se)、球(qiu)形、有核的血(xue)細胞(bao)。白細胞(bao)不是(shi)壹個(ge)均(jun)壹(yi)的(de)細胞群(qun)，根(gen)據其形態、功能和來(lai)源部(bu)位(wei)可(ke)以分為(wei)三(san)大類(lei)：粒細(xi)胞(bao)、單(dan)核細胞和淋巴細胞，其中(zhong)粒細(xi)胞(bao)又(you)可(ke)根據胞(bao)質(zhi)中(zhong)顆粒的(de)染色性(xing)質(zhi)不(bu)同，分為(wei)中性粒細(xi)胞(bao)、嗜酸粒細(xi)胞(bao)和嗜堿(jian)粒細(xi)胞(bao)三(san)種。根(gen)據白細胞(bao)的細(xi)胞(bao)質(zhi)內有(you)無特(te)殊(shu)顆粒，可(ke)將其分為(wei)有粒白細胞(bao)和無粒白細胞(bao)。前者常(chang)簡稱(cheng)為粒細(xi)胞(bao)，根據其特(te)殊(shu)顆粒的(de)染色特(te)性(xing)，又(you)分為(wei)中性粒細(xi)胞(bao)、嗜堿(jian)性(xing)粒細(xi)胞(bao)和嗜酸性(xing)粒細(xi)胞(bao)，白細胞(bao)也通(tong)常(chang)被稱(cheng)為免(mian)疫(yi)細胞(bao)。在顯微鏡(jing)下(xia)可(ke)以看到(dao)，血(xue)細(xi)胞中(zhong)體(ti)積比較大、數(shu)量比較少，具(ju)有(you)細胞核(he)；其主(zhu)要(yao)作用是(shi)吞(tun)噬細(xi)菌、防禦疾(ji)病。
方(fang)法簡(jian)介：

公(gong)司(si)實(shi)驗(yan)室(shi)分離(li)的兔外周(zhou)血白采(cai)用(yong)取(qu)外(wai)周(zhou)血、通(tong)過密度(du)梯(ti)度(du)離(li)心(xin)法制備而(er)來(lai)制備而(er)來(lai)，細胞(bao)總(zong)量約(yue)為5×10?cells/瓶(ping)。
質(zhi)量檢測：

公(gong)司(si)實(shi)驗(yan)室(shi)分離(li)的兔外周(zhou)血白經過(guo)檢測，且不(bu)含(han)有HIV-1、HBV、HCV、支原(yuan)體、細(xi)菌、酵母和真(zhen)菌(jun)等。

壹(yi)、細(xi)胞培(pei)養(yang)

1取(qu)材(cai) 在無菌(jun)環(huan)境(jing)下從(cong)機體取(qu)出某種組織細(xi)胞(bao)（視實(shi)驗(yan)目(mu)的而(er)定(ding)），經(jing)過(guo)壹定的(de)處理(li)（如消化(hua)分散(san)細(xi)胞、分離(li)等）後(hou)接(jie)入(ru)培(pei)養(yang)器(qi)血(xue)中，這壹(yi)過(guo)程(cheng)稱(cheng)為取(qu)材(cai)。如是(shi)細胞(bao)株的(de)擴大(da)培(pei)養(yang)則(ze)無取(qu)材(cai)這壹(yi)過(guo)程(cheng)。機體取(qu)出的組織細(xi)胞(bao)的培(pei)養(yang)稱(cheng)為原(yuan)代培(pei)養(yang)。2培(pei)養(yang) 將取(qu)得的組織細(xi)胞(bao)接(jie)入(ru)培(pei)養(yang)瓶(ping)或(huo)培(pei)養(yang)板(ban)中(zhong)的(de)過程稱(cheng)為培(pei)養(yang)。3凍(dong)存及復蘇（可(ke)參閱後(hou)面(mian)有關(guan)章節）為(wei)了(le)保存細胞(bao)，特(te)別是(shi)不易獲得的突變(bian)型細(xi)胞(bao)或(huo)細胞(bao)株，要(yao)將細胞(bao)凍存。凍存的溫度壹(yi)般(ban)用液氮的溫度－196℃，將細胞(bao)收集至凍(dong)存管中(zhong)加(jia)入含(han)保護劑(ji)（壹般(ban)為二甲亞(ya)碸或(huo)甘油(you)）的培(pei)養(yang)基，以壹(yi)定(ding)的冷(leng)卻(que)速度凍(dong)存，最終(zhong)保存於(yu)液氮中。在極低的(de)溫度下(xia)，細(xi)胞保存的時間幾乎(hu)是(shi)無限(xian)的(de)。復蘇壹(yi)般(ban)采(cai)用(yong)快融(rong)方法，即(ji)從液氮中取(qu)出凍存管後(hou)，立(li)即(ji)放(fang)入37℃水(shui)中(zhong)，使(shi)之在壹分鐘(zhong)內迅(xun)速(su)融(rong)解(jie)。然(ran)後(hou)將細胞(bao)轉入(ru)培(pei)養(yang)器(qi)皿(min)中進(jin)行(xing)培(pei)養(yang)。

二、原(yuan)代細胞(bao)分離(li)

凡(fan)是(shi)來(lai)源於(yu)胚胎(tai)、組織器(qi)官(guan)及外(wai)周(zhou)血，經(jing)特殊分離(li)方法制備而(er)來(lai)的原(yuan)初培(pei)養(yang)的(de)細(xi)胞稱(cheng)之為(wei)原(yuan)代細胞(bao)。1懸(xuan)浮細(xi)胞(bao)的分離(li)方法組織材(cai)料若(ruo)來(lai)自血(xue)液、羊水、胸(xiong)水或(huo)腹(fu)水(shui)的(de)懸(xuan)液材(cai)料，的(de)方(fang)法是(shi)采(cai)用(yong)1000r/min的(de)低(di)速(su)離心(xin)10分鐘(zhong)。經離心(xin)後(hou)由於(yu)各種細(xi)胞(bao)的比重(zhong)不同可(ke)在分層(ceng)液中(zhong)形成不同層，這樣(yang)可(ke)根據需要(yao)收獲目的(de)細胞。2實(shi)體組織材(cai)料的(de)分離(li)方法對(dui)於(yu)實體(ti)組織材(cai)料，由於(yu)細胞(bao)間結合(he)緊密，為了(le)使(shi)組織中(zhong)的(de)細胞(bao)充(chong)分分散(san)，形成細胞懸(xuan)液，可(ke)采(cai)用(yong)機械分散(san)法（物理(li)裂解）和消化(hua)分離(li)法。

三(san)、細胞(bao)增(zeng)殖檢(jian)測技術(shu)

目(mu)前主(zhu)要(yao)有兩種用(yong)於(yu)檢測細胞(bao)增(zeng)殖能力的方法。壹(yi)種是(shi)直接(jie)的(de)方(fang)法，通(tong)過直(zhi)接(jie)測定進(jin)行(xing)分裂

的(de)細(xi)胞數(shu)來(lai)評價細胞(bao)的(de)增(zeng)殖能力。另(ling)壹種是(shi)間接(jie)的(de)方(fang)法，即(ji)細胞(bao)活力（cell viability）檢測方法，通(tong)過檢(jian)測樣品(pin)中健康細胞(bao)的數(shu)目來(lai)評價細胞(bao)的(de)增(zeng)殖能力。顯然(ran)，細(xi)胞活(huo)力檢測法並(bing)不能最終證明檢測樣品(pin)中的(de)細胞是(shi)否在增(zeng)殖。如(ru)細胞(bao)在某壹(yi)培(pei)養(yang)條件下(xia)會(hui)自發啟動雕(diao)亡(wang)程序(xu)，但藥物的(de)幹(gan)擾(rao)可(ke)抑(yi)制雕(diao)亡(wang)的發生(sheng)；這時若(ruo)采(cai)用(yong)細(xi)胞(bao)活(huo)力檢測法，顯然(ran)可(ke)以區(qu)分兩種條件下(xia)的(de)細胞(bao)數(shu)量，但我們並(bing)不能從藥物幹(gan)擾(rao)組細(xi)胞數(shu)大於(yu)對照組的(de)事實說(shuo)明藥物可(ke)促進(jin)細(xi)胞增(zeng)殖的(de)結論(lun)。所以最(zui)直(zhi)接(jie)的(de)證(zheng)據應該(gai)采(cai)用(yong)方(fang)法壹(yi)。

取(qu)材(cai)：首先，用培(pei)養(yang)液濕(shi)潤(run)所(suo)取(qu)的(de)組織材(cai)料，並(bing)用鋒(feng)利的眼科剪去除附在其上的脂肪(fang)和結締(di)組織。接(jie)著(zhe)用(yong)平(ping)衡(heng)液（如(ru)PBS或(huo)Hanks液）漂(piao)洗，再用(yong)眼科彎(wan)剪(jian)將組織塊(kuai)剪(jian)成(cheng)小(xiao)塊(kuai)。多次(ci)用(yong)PBS或(huo)Hanks液漂(piao)洗，直到(dao)液體(ti)清亮(liang)、無油(you)滴(di)為止(zhi)。

接(jie)種(zhong)：用(yong)濕(shi)潤(run)的(de)吸(xi)管吸(xi)取(qu)切(qie)碎的組織塊(kuai)，輕輕吹到(dao)培(pei)養(yang)瓶(ping)皿(min)中，並(bing)按壹定(ding)間距均(jun)勻放(fang)在培(pei)養(yang)瓶(ping)底(di)壁(bi)上。註意不(bu)要(yao)過多，確(que)保組織塊(kuai)切(qie)面(mian)貼(tie)在培(pei)養(yang)瓶(ping)底(di)壁(bi)上。

培(pei)養(yang)：將培(pei)養(yang)瓶(ping)翻(fan)轉，使(shi)瓶底(di)朝上，在種植(zhi)了(le)組織塊(kuai)壹(yi)側(ce)的(de)對側面(mian)加(jia)足培(pei)養(yang)液，避(bi)免組織塊(kuai)與(yu)培(pei)養(yang)液接(jie)觸(chu)，然後(hou)塞(sai)緊瓶塞。將種植(zhi)了(le)組織塊(kuai)的(de)壹(yi)側(ce)朝上，靜(jing)置(zhi)於(yu)37℃培(pei)養(yang)箱(xiang)中(zhong)。待(dai)組織塊(kuai)貼(tie)壁(bi)1到(dao)3小(xiao)時後(hou)翻(fan)瓶，使(shi)貼(tie)壁(bi)的(de)組織塊(kuai)浸沒在培(pei)養(yang)液中(zhong)，繼續(xu)靜(jing)置(zhi)。換(huan)液：每隔(ge)2到(dao)3天(tian)更(geng)換(huan)壹次(ci)培(pei)養(yang)液，或(huo)者根(gen)據培(pei)養(yang)瓶(ping)種(zhong)顏色(se)的變化(hua)確(que)定換(huan)液時間。

壹(yi)、原(yuan)代細胞(bao)計(ji)數(shu)

將血球(qiu)計(ji)數(shu)板(ban)及(ji)蓋片用(yong)擦試(shi)幹(gan)凈(jing)，並(bing)將蓋片蓋在計(ji)數(shu)板(ban)上。

將細胞(bao)懸(xuan)液吸(xi)出少許(xu)，滴(di)加(jia)在蓋片邊(bian)緣，使(shi)懸(xuan)液充(chong)滿(man)蓋片和計(ji)數(shu)板(ban)之(zhi)間。

靜(jing)置(zhi)3分鐘(zhong)。

鏡(jing)下(xia)觀(guan)察(cha)，計(ji)算計(ji)數(shu)板(ban)四大(da)格(ge)細胞(bao)總(zong)數(shu)，壓(ya)線細(xi)胞只計(ji)左側(ce)和上方的。然(ran)後(hou)按(an)下式(shi)計(ji)算：

細(xi)胞(bao)數(shu)/ml＝4大格(ge)細胞(bao)總(zong)數(shu)/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡(jing)下(xia)偶見由兩個以上細胞組成(cheng)的細胞團(tuan)，應按(an)單(dan)個細胞計(ji)算，若(ruo)細(xi)胞團(tuan)占(zhan)10%以上，說明分散(san)不(bu)好(hao)，需重(zhong)新制備細(xi)胞(bao)懸(xuan)液。

二、原(yuan)代細胞(bao)活(huo)力

將細胞(bao)懸(xuan)液以0.5ml加(jia)入試(shi)管中(zhong)。

加(jia)入0.5ml 0.4%臺盼(pan)蘭染液，染色2壹(yi)3分鐘(zhong)。

吸(xi)取(qu)少(shao)許(xu)懸(xuan)液塗(tu)於(yu)載玻(bo)片上，加(jia)上蓋片。

鏡(jing)下(xia)取(qu)幾個(ge)任意(yi)視野分別計(ji)死細胞(bao)和活細(xi)胞數(shu)，計(ji)細胞(bao)活力。

死細胞(bao)能被臺盼(pan)蘭染上色，鏡(jing)下(xia)可(ke)見深(shen)蘭(lan)色(se)的(de)細(xi)胞，活細胞(bao)不被染色，鏡(jing)下(xia)呈(cheng)無色(se)透明狀。

活(huo)力(li)測定可(ke)以和細胞(bao)計(ji)數(shu)合起來(lai)進(jin)行(xing)，但要(yao)考(kao)慮(lv)到染液對(dui)原(yuan)細胞(bao)懸(xuan)液的(de)加(jia)倍(bei)稀釋(shi)作用。