【概(gai)要描(miao)述】鼠抗人(ren)Bcl-XL單克(ke)隆抗體 Bcl-XLWestern免(mian)疫印(yin)跡(ji)對(dui)已(yi)知表達(da)蛋白(bai)，可用相(xiang)應抗體作(zuo)為(wei)壹抗進行檢(jian)測(ce)，對(dui)新(xin)基(ji)因的(de)表達(da)產物(wu)，可通過(guo)融合(he)部分(fen)的(de)抗體檢(jian)測(ce)。

鼠抗人(ren)Bcl-XL單克(ke)隆抗體 Bcl-XLWestern Blot技術(shu):
壹(yi)、 原(yuan)理
與Southern或Northern雜交方(fang)法類(lei)似(si)，但Western Blot采用的是(shi)聚(ju)丙烯酰(xian)胺(an)凝(ning)膠電(dian)泳(yong)，被(bei)檢(jian)測(ce)物(wu)是(shi)蛋(dan)白質，“探針(zhen)”是(shi)抗體，“顯(xian)色”用標記(ji)的二(er)抗。經過(guo)PAGE分(fen)離的蛋白(bai)質樣(yang)品(pin)，轉(zhuan)移(yi)到固相(xiang)載體（例如硝(xiao)#纖(xian)維素薄膜）上(shang)，固相(xiang)載體以非(fei)共價鍵形(xing)式(shi)吸(xi)附蛋白質，且(qie)能保持電(dian)泳(yong)分(fen)離的多肽(tai)類(lei)型及(ji)其生(sheng)物(wu)學(xue)活性不變。以固相(xiang)載體上(shang)的蛋(dan)白(bai)質或多肽(tai)作(zuo)為(wei)抗原(yuan)，與對(dui)應的抗體起(qi)免(mian)疫反(fan)應，再與酶(mei)或同(tong)位素標記(ji)的第(di)二(er)抗體起(qi)反(fan)應，經過(guo)底物(wu)顯色或放射(she)自(zi)顯(xian)影以檢(jian)測(ce)電(dian)泳(yong)分(fen)離的特(te)異性目的基(ji)因表達(da)的蛋(dan)白成分(fen)。該(gai)技術(shu)也廣泛(fan)應用於檢(jian)測(ce)蛋(dan)白(bai)水平(ping)的(de)表達(da)。
二、分(fen)類(lei)
現(xian)常用的有(you)底物(wu)化(hua)學(xue)發(fa)光ECL和(he)底物(wu)DAB呈(cheng)色，體同(tong)水平(ping)和(he)實驗(yan)條(tiao)件(jian)的是(shi)用*種(zhong)方法(fa)，目前發(fa)表文章(zhang)通常是(shi)用底物(wu)化(hua)學(xue)發(fa)光ECL。只(zhi)要買(mai)現(xian)成的(de)試劑(ji)盒(he)就(jiu)行，操(cao)作(zuo)也比較簡(jian)單，原(yuan)理如下（二抗用HRP標記(ji)）：反應底物(wu)為(wei)過(guo)氧化(hua)物(wu)+魯米(mi)諾，如遇(yu)到HRP，即發(fa)光，可(ke)使膠片曝(pu)光，就(jiu)可洗(xi)出(chu)條(tiao)帶(dai)。
三、主(zhu)要試劑(ji)鼠抗人(ren)Bcl-XL單克(ke)隆抗體 Bcl-XLWestern
、 丙(bing)烯酰(xian)胺(an)和(he)N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙烯酰(xian)胺(an)，應以溫熱（以利於(yu)溶解雙丙稀酰(xian)胺(an)）的(de)去(qu)離子(zi)水配(pei)制(zhi)含(han)有(you)29%（w/v）丙(bing)稀酰(xian)胺(an)和(he)%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙烯酰(xian)胺(an)儲(chu)存(cun)液(ye)丙稀酰(xian)胺(an)29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉雙(shuang)丙(bing)稀酰(xian)胺(an)g，加H2O至(zhi) 00ml。）儲於(yu)棕(zong)色瓶，4℃避光保存。嚴(yan)格(ge)核(he)實PH不得(de)超(chao)過(guo)7.0，因可以發生脫(tuo)氨基(ji)反應是(shi)光催(cui)化(hua)或堿(jian)催(cui)化(hua)的(de)。使用期不得(de)超(chao)過(guo)兩個月(yue)，隔幾(ji)個月(yue)須(xu)重(zhong)新(xin)配(pei)制(zhi)。如有(you)沈(chen)澱，可以過(guo)濾。
2、 十二烷基(ji)硫#鈉(na)SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離子(zi)水配(pei)制(zhi)，室溫(wen)保存。
3、 分(fen)離膠緩沖液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混合(he)，加水稀釋(shi)到(dao)00ml終(zhong)體積(ji)。過(guo)濾後(hou)40℃保存。
Bcl-XLWestern 4、 濃縮膠(jiao)緩(huan)沖液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於40mlH2O中，用約48ml mol/L HCl調至(zhi)pH6.8加水稀釋(shi)到(dao)00ml終(zhong)體積(ji)。過(guo)濾後(hou)40C保存。這(zhe)兩種(zhong)緩沖液必(bi)須使用Tris堿(jian)制(zhi)備(bei)，再用HCL調節(jie)PH值(zhi)，而(er)不用 Tris.CL。
5、 TEMED原(yuan)溶液(ye)N，N，N’N’四(si)甲(jia)基(ji)乙二(er)胺催(cui)化(hua)過(guo)硫#銨(an)形(xing)成自(zi)由基(ji)而(er)加速(su)兩種(zhong)丙稀酰(xian)胺(an)的(de)聚(ju)合(he)。PH太(tai)低時，聚合(he)反(fan)應受到(dao)抑(yi)制(zhi)。0%（w/v）過(guo)硫#胺溶液。提供兩(liang)種(zhong)丙稀酰(xian)胺(an)聚(ju)合(he)所(suo)必須(xu)的(de)自(zi)由基(ji)。去(qu)離子(zi)水配(pei)制(zhi)數ml，臨用前配(pei)制(zhi).
6、 SDS- PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖液8ml，甘油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚(fen)藍.6ml，H2O 32ml混(hun)勻備(bei)用。按(an):或:2比例與蛋(dan)白(bai)質樣(yang)品(pin)混(hun)合(he)，在(zai)沸水終(zhong)煮(zhu)3min混勻後(hou)再上(shang)樣(yang)，壹(yi)般(ban)為(wei)20-25ul，總(zong)蛋(dan)白量(liang)00μg。
7、 Tris-甘氨#電(dian)泳(yong)緩沖液:30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用蒸(zheng)餾水溶(rong)解至(zhi)000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電(dian)極(ji)緩沖液。臨(lin)用前稀釋(shi)0倍(bei)。
8、 轉(zhuan)移(yi)緩沖液：配(pei)制(zhi)L轉(zhuan)移(yi)緩沖液，需稱取(qu)2.9g甘氨#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入200ml甲醇，加水至(zhi)總(zong)量(liang)L。
9、 麗(li)春紅染液(ye)儲(chu)存(cun)液：麗(li)春紅(hong)S 2g 三#乙#30g 磺基(ji)水楊# 30g 加水至(zhi)00ml 用時上述(shu)儲(chu)存液稀釋(shi)0倍(bei)即成麗(li)春(chun)紅(hong)S使用液。使用後(hou)應予以廢棄。
0、 脫(tuo)脂(zhi)奶粉(fen)5%（w/v）。
、 NaN3 0.02% 疊(die)氮(dan)鈉(na)（有(you)毒(du)，戴(dai)手(shou)套操(cao)作(zuo)），溶(rong)於(yu)磷#緩沖鹽溶(rong)液（PBS）。
2、 Tris緩沖鹽溶(rong)液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。
3、 Tween20（5）鼠抗人(ren)-MMP-9（6）鼠抗人(ren)-TIMP-。
4、 過(guo)氧化(hua)物(wu)酶(mei)標記(ji)的第(di)二(er)抗體。
5、 NBT（溶(rong)於(yu)70%二甲(jia)基(ji)甲酰(xian)胺(an)，75mg/ml）。
6、 BCIP（溶(rong)於(yu)00%二(er)甲基(ji)甲酰(xian)胺(an)，50mg/ml）。
7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。
8、 00mmol/L NaCl。
9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。（可(ke)以參看分(fen)子(zi)克隆）