【概要(yao)描(miao)述(shu)】兔外周血單(dan)個核細胞(bao)的相關(guan)產(chan)品(pin)：94T778人高(gao)分化脂(zhi)肪(fang)肉(rou)瘤細胞(bao)人(ren)原代(dai)內皮(pi)祖(zu)細胞(bao)兔原代(dai)肺動脈內(nei)皮(pi)細胞(bao)大鼠原代(dai)腦(nao)動脈血管內(nei)皮(pi)細胞(bao)人原代(dai)結腸(chang)間質(zhi)細(xi)胞（便秘患(huan)者(zhe)）人(ren)原代(dai)臍(qi)帶間充質(zhi)幹(gan)細胞(bao)人(ren)原代(dai)腎上(shang)腺(xian)皮質(zhi)細(xi)胞人原代(dai)睪(gao)丸(wan)血管內(nei)皮(pi)細胞(bao)大鼠腎(shen)臟(zang)巨噬細胞(bao)人(ren)原代(dai)胰(yi)腺(xian)癌相關(guan)成纖維(wei)細(xi)胞(bao)

兔外周血單(dan)個核細胞(bao)

培養基(ji) 含(han)FBS、生長(chang)添(tian)加劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液(ye)頻(pin)率(lv) 每2-3天換(huan)液壹次

生長(chang)特(te)性 懸浮(fu)

細胞(bao)形(xing)態(tai) 圓形(xing)

傳代(dai)特性(xing) 不增殖；不(bu)傳(chuan)代(dai)

消化液(ye) 0.25%yi蛋白(bai)酶

培養條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔外周血單(dan)個核分離自(zi)外周血；外周血是(shi)除(chu)骨髓(sui)之(zhi)外的血液，臨(lin)床(chuang)上常(chang)用壹些(xie)方(fang)法(fa)把(ba)骨髓(sui)中的造(zao)血幹(gan)細胞(bao)釋(shi)放(fang)到血液中，再在(zai)從(cong)血液中提(ti)取分離得到(dao)造(zao)血幹(gan)細胞(bao)，我們(men)把這樣得(de)到的幹(gan)細胞(bao)稱(cheng)為外周血幹(gan)細胞(bao)，在(zai)二(er)十(shi)壹世紀(ji)初人(ren)類(lei)開(kai)始(shi)的生(sheng)命方(fang)舟計劃(hua)中提(ti)出外周血這壹新概念。外周血單(dan)個核細胞(bao)（PBMC）即(ji)外周血中具(ju)有單(dan)個核的細(xi)胞(bao)，包(bao)括淋(lin)巴(ba)細胞(bao)和(he)單(dan)核(he)細(xi)胞(bao)。目(mu)前，主(zhu)要的分離方法(fa)是(shi)密度(du)梯(ti)度離心法，因為(wei)血液中各(ge)有形成分的比(bi)重(zhong)存在(zai)差異(yi)，因此(ci)得以(yi)分離出不(bu)同(tong)的細(xi)胞(bao)。
方法(fa)簡(jian)介(jie)：

公司(si)實驗室分離的兔外周血單(dan)個核采用取(qu)外周血、通(tong)過(guo)密度梯(ti)度離心法制(zhi)備(bei)而來制(zhi)備(bei)而來，細(xi)胞(bao)總(zong)量約為(wei)5×10?cells/瓶(ping)。
質(zhi)量(liang)檢(jian)測：

公司(si)實驗室分離的兔外周血單(dan)個核經過(guo)檢(jian)測，且不(bu)含(han)有HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原體(ti)、細(xi)菌(jun)、酵母(mu)和(he)真(zhen)菌(jun)等(deng)。

壹、細胞培養

1取材(cai) 在(zai)無菌(jun)環(huan)境(jing)下(xia)從機(ji)體(ti)取(qu)出(chu)某種組(zu)織(zhi)細(xi)胞（視(shi)實驗目(mu)的而定），經過(guo)壹定的處(chu)理(li)（如消(xiao)化分散(san)細(xi)胞(bao)、分離等(deng)）後(hou)接入(ru)培養器(qi)血中，這壹過(guo)程稱為取材。如(ru)是(shi)細胞(bao)株的擴(kuo)大培養則(ze)無取(qu)材這壹過(guo)程。機(ji)體(ti)取(qu)出(chu)的組(zu)織(zhi)細(xi)胞的培養稱(cheng)為(wei)原代(dai)培養。2培養 將(jiang)取(qu)得的組(zu)織(zhi)細(xi)胞接入(ru)培養瓶(ping)或(huo)培養板中的過(guo)程稱為培養。3凍存(cun)及復(fu)蘇（可參閱(yue)後(hou)面(mian)有關章(zhang)節(jie)）為了保存細胞，特別是(shi)不易(yi)獲得(de)的突變(bian)型細(xi)胞(bao)或(huo)細(xi)胞(bao)株，要將(jiang)細(xi)胞凍存(cun)。凍存(cun)的溫(wen)度(du)壹般(ban)用液(ye)氮的溫(wen)度(du)－196℃，將(jiang)細(xi)胞收(shou)集至(zhi)凍存(cun)管中加入含(han)保護(hu)劑(ji)（壹般(ban)為二(er)甲(jia)亞碸(feng)或(huo)甘(gan)油）的培養基(ji)，以(yi)壹定的冷卻(que)速(su)度(du)凍存(cun)，最終保(bao)存於液氮(dan)中。在(zai)極(ji)低(di)的溫(wen)度(du)下(xia)，細胞(bao)保(bao)存的時(shi)間幾乎是(shi)無限的。復(fu)蘇壹般(ban)采用快(kuai)融(rong)方(fang)法(fa)，即(ji)從液(ye)氮中取(qu)出(chu)凍存(cun)管後(hou)，立(li)即(ji)放(fang)入37℃水(shui)中，使之(zhi)在(zai)壹分鐘(zhong)內(nei)迅(xun)速(su)融(rong)解。然後(hou)將(jiang)細(xi)胞轉(zhuan)入培養器(qi)皿(min)中進(jin)行培養。

二(er)、原代(dai)細胞(bao)分離

凡是(shi)來源(yuan)於胚(pei)胎、組(zu)織(zhi)器(qi)官(guan)及(ji)外周血，經特(te)殊分離方法(fa)制(zhi)備(bei)而來的原初(chu)培養的細(xi)胞(bao)稱之(zhi)為原代(dai)細胞(bao)。1懸浮(fu)細胞的分離方法(fa)組(zu)織(zhi)材(cai)料若(ruo)來自(zi)血液、羊水(shui)、胸(xiong)水或(huo)腹(fu)水(shui)的懸(xuan)液(ye)材料(liao)，的方(fang)法(fa)是(shi)采用1000r/min的低(di)速(su)離心10分鐘(zhong)。經(jing)離心後由於各(ge)種細(xi)胞的比(bi)重(zhong)不同(tong)可在(zai)分層(ceng)液中形(xing)成不同(tong)層(ceng)，這樣可(ke)根據需要(yao)收(shou)獲目(mu)的細(xi)胞(bao)。2實體組(zu)織(zhi)材(cai)料的分離方法(fa)對於實體組(zu)織(zhi)材(cai)料，由於細胞(bao)間結合(he)緊密(mi)，為(wei)了使組(zu)織(zhi)中的細(xi)胞(bao)充分分散(san)，形(xing)成細胞(bao)懸(xuan)液，可采用機(ji)械(xie)分散(san)法(fa)（物(wu)理(li)裂(lie)解）和消(xiao)化分離法。

三、細(xi)胞增殖檢(jian)測技(ji)術

目(mu)前主(zhu)要有兩(liang)種用(yong)於檢(jian)測細(xi)胞(bao)增殖能(neng)力(li)的方(fang)法(fa)。壹種是(shi)直(zhi)接的方(fang)法(fa)，通(tong)過(guo)直(zhi)接測定進(jin)行分裂(lie)

的細(xi)胞(bao)數來評(ping)價細(xi)胞(bao)的增殖能(neng)力(li)。另(ling)壹種是(shi)間接的方(fang)法(fa)，即(ji)細胞(bao)活(huo)力(li)（cell viability）檢(jian)測方(fang)法(fa)，通(tong)過(guo)檢(jian)測樣品(pin)中健康細胞(bao)的數(shu)目(mu)來評(ping)價細(xi)胞(bao)的增殖能(neng)力(li)。顯(xian)然(ran)，細(xi)胞活(huo)力(li)檢(jian)測法(fa)並不能(neng)最終證(zheng)明(ming)檢(jian)測樣品(pin)中的細(xi)胞(bao)是(shi)否在(zai)增殖。如(ru)細(xi)胞在(zai)某(mou)壹培養條件下(xia)會(hui)自(zi)發啟(qi)動雕(diao)亡(wang)程(cheng)序，但藥(yao)物(wu)的幹(gan)擾可抑(yi)制(zhi)雕(diao)亡(wang)的發(fa)生(sheng)；這時(shi)若(ruo)采用細(xi)胞活(huo)力(li)檢(jian)測法(fa)，顯(xian)然可(ke)以(yi)區分兩(liang)種條件下(xia)的細(xi)胞(bao)數量(liang)，但我們(men)並不能(neng)從(cong)藥(yao)物(wu)幹(gan)擾組(zu)細(xi)胞(bao)數大於對照組(zu)的事(shi)實說(shuo)明(ming)藥(yao)物(wu)可(ke)促進(jin)細(xi)胞(bao)增殖的結論。所以(yi)最直(zhi)接的證(zheng)據應(ying)該采用方(fang)法壹。

取材(cai)：首(shou)先(xian)，用(yong)培養液(ye)濕(shi)潤(run)所取的組(zu)織(zhi)材(cai)料，並用鋒利的眼(yan)科剪去(qu)除(chu)附(fu)在(zai)其(qi)上的脂(zhi)肪(fang)和結締組(zu)織(zhi)。接著(zhe)用(yong)平衡液(ye)（如(ru)PBS或(huo)Hanks液(ye)）漂(piao)洗，再用眼(yan)科彎剪將(jiang)組(zu)織(zhi)塊(kuai)剪(jian)成小塊(kuai)。多次用PBS或(huo)Hanks液(ye)漂(piao)洗，直(zhi)到(dao)液體(ti)清(qing)亮(liang)、無油滴為止。

接種：用(yong)濕(shi)潤(run)的吸(xi)管吸(xi)取(qu)切碎的組(zu)織(zhi)塊(kuai)，輕(qing)輕吹到(dao)培養瓶(ping)皿中，並按壹定間距均(jun)勻(yun)放(fang)在(zai)培養瓶(ping)底壁上(shang)。註(zhu)意(yi)不要過(guo)多，確(que)保組(zu)織(zhi)塊(kuai)切面(mian)貼(tie)在(zai)培養瓶(ping)底壁上(shang)。

培養：將(jiang)培養瓶(ping)翻轉(zhuan)，使瓶(ping)底朝上(shang)，在(zai)種植了組(zu)織(zhi)塊(kuai)壹側的對側面(mian)加足培養液(ye)，避(bi)免組(zu)織(zhi)塊(kuai)與(yu)培養液(ye)接觸(chu)，然後(hou)塞(sai)緊瓶(ping)塞(sai)。將(jiang)種植了組(zu)織(zhi)塊(kuai)的壹側朝上(shang)，靜(jing)置(zhi)於37℃培養箱中。待(dai)組(zu)織(zhi)塊(kuai)貼(tie)壁1到(dao)3小時後翻瓶(ping)，使貼(tie)壁的組(zu)織(zhi)塊(kuai)浸(jin)沒(mei)在(zai)培養液(ye)中，繼續(xu)靜置(zhi)。換(huan)液(ye)：每(mei)隔2到3天更(geng)換(huan)壹次培養液(ye)，或(huo)者(zhe)根(gen)據培養瓶(ping)種顏色的變(bian)化確(que)定換液(ye)時間。

壹、原代(dai)細胞(bao)計數(shu)

將(jiang)血球計數(shu)板及(ji)蓋(gai)片(pian)用(yong)擦試幹(gan)凈，並將(jiang)蓋(gai)片(pian)蓋(gai)在(zai)計數(shu)板上(shang)。

將(jiang)細(xi)胞懸(xuan)液吸(xi)出少許(xu)，滴加在(zai)蓋(gai)片(pian)邊(bian)緣(yuan)，使懸液(ye)充滿(man)蓋(gai)片(pian)和(he)計數(shu)板之(zhi)間。

靜置(zhi)3分鐘(zhong)。

鏡下(xia)觀察(cha)，計算(suan)計數(shu)板四(si)大格細胞(bao)總(zong)數，壓線(xian)細(xi)胞只計左側和上方的。然(ran)後(hou)按下(xia)式計算(suan)：

細胞(bao)數(shu)/ml＝4大格細胞(bao)總(zong)數/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡下(xia)偶(ou)見(jian)由兩(liang)個以(yi)上(shang)細(xi)胞組(zu)成的細(xi)胞(bao)團，應(ying)按單(dan)個細胞計算(suan)，若(ruo)細(xi)胞(bao)團占10%以(yi)上(shang)，說(shuo)明(ming)分散(san)不(bu)好，需(xu)重(zhong)新制(zhi)備(bei)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液。

二(er)、原代(dai)細胞(bao)活(huo)力(li)

將(jiang)細(xi)胞懸(xuan)液以(yi)0.5ml加入試管中。

加入0.5ml 0.4%臺(tai)盼(pan)蘭(lan)染(ran)液，染(ran)色2壹3分鐘(zhong)。

吸取(qu)少(shao)許(xu)懸(xuan)液(ye)塗(tu)於載玻(bo)片(pian)上(shang)，加上蓋(gai)片(pian)。

鏡下(xia)取幾個任意(yi)視(shi)野(ye)分別(bie)計死細胞和活(huo)細(xi)胞(bao)數(shu)，計細(xi)胞活(huo)力(li)。

死細胞能(neng)被(bei)臺(tai)盼(pan)蘭(lan)染(ran)上色，鏡下(xia)可見(jian)深蘭(lan)色的細(xi)胞(bao)，活(huo)細(xi)胞(bao)不(bu)被(bei)染(ran)色，鏡下(xia)呈無色透(tou)明(ming)狀。

活(huo)力(li)測定可以(yi)和(he)細(xi)胞計數(shu)合起來進(jin)行，但要考慮到(dao)染(ran)液對原細(xi)胞(bao)懸液(ye)的加倍稀(xi)釋(shi)作(zuo)用(yong)。