【概要描(miao)述(shu)】兔外(wai)周(zhou)血巨(ju)噬細(xi)胞(bao)的相(xiang)關產品(pin)：7721-coGFP-puro人肝(gan)癌細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代(dai)NK細(xi)胞(bao)人原(yuan)代(dai)牙(ya)周膜(mo)幹細(xi)胞(bao)小鼠(shu)原代腎集(ji)合管上(shang)皮細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代(dai)牙(ya)齦成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代(dai)α-SMA陽性(xing) 腎周(zhou)肌(ji)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)豬原(yuan)代(dai)前(qian)體(ti)脂(zhi)肪細(xi)胞(bao)人原(yuan)代(dai)臍血間充質幹細(xi)胞(bao)大鼠(shu)原代腦微血管周(zhou)細(xi)胞(bao)人原(yuan)代(dai)骨髓巨(ju)噬細(xi)胞(bao)

兔外(wai)周(zhou)血巨(ju)噬細(xi)胞(bao)

培(pei)養基 含(han)FBS、生長(chang)添加劑、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換(huan)液(ye)頻率 每2-3天(tian)換(huan)液(ye)壹次(ci)

生長(chang)特性(xing) 貼(tie)壁(bi)

細(xi)胞(bao)形態(tai) 巨(ju)噬細(xi)胞(bao)樣(yang)

傳(chuan)代(dai)特性(xing) 屬(shu)於(yu)終(zhong)末(mo)分(fen)化(hua)細(xi)胞(bao)；屬(shu)於(yu)不(bu)增殖(zhi)細(xi)胞(bao)群

消化(hua)液(ye) 利(li)多ka因（12mM）

培(pei)養條件 氣相：空(kong)氣，95%；CO2，5%

兔外(wai)周(zhou)血巨(ju)噬分(fen)離自(zi)外(wai)周血；外周(zhou)血是(shi)除(chu)骨髓之(zhi)外的(de)血液(ye)，臨(lin)床(chuang)上(shang)常用壹些(xie)方(fang)法(fa)把(ba)骨(gu)髓中(zhong)的造(zao)血幹細(xi)胞(bao)釋(shi)放(fang)到血液(ye)中，再(zai)在(zai)從(cong)血液(ye)中提(ti)取(qu)分(fen)離得(de)到造(zao)血幹細(xi)胞(bao)，我們把(ba)這(zhe)樣(yang)得(de)到的(de)幹細(xi)胞(bao)稱為(wei)外(wai)周(zhou)血幹細(xi)胞(bao)，在二(er)十(shi)壹世(shi)紀初人類(lei)開(kai)始(shi)的生命方(fang)舟計劃中提(ti)出外(wai)周(zhou)血這壹新(xin)概(gai)念。巨(ju)噬細(xi)胞(bao)屬(shu)免(mian)疫細(xi)胞(bao)，有多(duo)種功(gong)能(neng)，是(shi)研究細(xi)胞(bao)吞(tun)噬、細(xi)胞(bao)免(mian)疫和(he)分(fen)子(zi)免(mian)疫學(xue)的(de)重(zhong)要對象(xiang)。巨(ju)噬細(xi)胞(bao)較(jiao)易獲(huo)得(de)，便於培(pei)養，並可(ke)進(jin)行(xing)純化(hua)。巨(ju)噬細(xi)胞(bao)屬(shu)不(bu)繁(fan)殖(zhi)細(xi)胞(bao)群，在條件適(shi)宜(yi)下(xia)可(ke)生活(huo)2-3周(zhou)，多用做(zuo)原代(dai)培(pei)養，難(nan)以長(chang)期(qi)生存。巨(ju)噬細(xi)胞(bao)（Macrophages）是(shi)壹種位(wei)於(yu)組織(zhi)內(nei)的白血球，源(yuan)自(zi)單(dan)核(he)細(xi)胞(bao)，而單(dan)核(he)細(xi)胞(bao)又來(lai)源(yuan)於(yu)骨(gu)髓中(zhong)的前(qian)體(ti)細(xi)胞(bao)。巨(ju)噬細(xi)胞(bao)和(he)單核(he)細(xi)胞(bao)皆為吞(tun)噬細(xi)胞(bao)，在脊椎(zhui)動物體(ti)內(nei)參與非(fei)特異性(xing)防衛（先天(tian)性(xing)免(mian)疫）和(he)特異性(xing)防衛（細(xi)胞(bao)免(mian)疫）。它(ta)們(men)的主(zhu)要功(gong)能(neng)是(shi)以固(gu)定細(xi)胞(bao)或(huo)遊(you)離細(xi)胞(bao)的形(xing)式(shi)對細(xi)胞(bao)殘(can)片(pian)及(ji)病(bing)原體(ti)進(jin)行(xing)噬菌作用（即吞(tun)噬以及(ji)消化(hua)），並激活(huo)淋巴(ba)球或(huo)其他(ta)免(mian)疫細(xi)胞(bao)，令(ling)其對病(bing)原體(ti)作(zuo)出反(fan)應。
方(fang)法(fa)簡介(jie)：

公(gong)司實驗室(shi)分(fen)離的兔外(wai)周(zhou)血巨(ju)噬采用取(qu)外周血、通過密(mi)度梯(ti)度離心法(fa)、差(cha)速貼(tie)壁(bi)、細(xi)胞(bao)因子(zi)誘(you)導(dao)法(fa)制備而(er)來(lai)，細(xi)胞(bao)總(zong)量約為5×10?cells/瓶。
質量(liang)檢測：

公(gong)司實驗室(shi)分(fen)離的兔外(wai)周(zhou)血巨(ju)噬經(jing)CD68免(mian)疫熒光(guang)鑒定，純(chun)度(du)可(ke)達(da)90%以上(shang)，且(qie)不(bu)含(han)有HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原體(ti)、細(xi)菌(jun)、酵(jiao)母和(he)真(zhen)菌等(deng)。

壹、細(xi)胞(bao)培(pei)養

1取(qu)材(cai) 在無(wu)菌(jun)環(huan)境(jing)下(xia)從機體(ti)取(qu)出某(mou)種組織(zhi)細(xi)胞(bao)（視實驗目(mu)的而定），經(jing)過壹定的(de)處(chu)理（如消化(hua)分(fen)散(san)細(xi)胞(bao)、分(fen)離等(deng)）後接(jie)入(ru)培(pei)養器(qi)血中，這(zhe)壹過程稱(cheng)為取(qu)材(cai)。如是(shi)細(xi)胞(bao)株的(de)擴(kuo)大培(pei)養則無(wu)取(qu)材(cai)這壹過程。機體(ti)取(qu)出的(de)組織(zhi)細(xi)胞(bao)的培(pei)養稱為(wei)原代(dai)培(pei)養。2培(pei)養 將取(qu)得(de)的組織(zhi)細(xi)胞(bao)接入(ru)培(pei)養瓶或(huo)培(pei)養板中的過程稱(cheng)為培(pei)養。3凍存及(ji)復蘇（可(ke)參閱後面(mian)有(you)關章節）為(wei)了(le)保存細(xi)胞(bao)，特別是(shi)不(bu)易獲(huo)得(de)的突(tu)變型(xing)細(xi)胞(bao)或(huo)細(xi)胞(bao)株，要將細(xi)胞(bao)凍存。凍存的(de)溫度(du)壹般(ban)用液(ye)氮的溫度(du)－196℃，將細(xi)胞(bao)收(shou)集(ji)至(zhi)凍存管(guan)中加(jia)入含保護劑（壹般(ban)為(wei)二(er)甲(jia)亞碸或(huo)甘(gan)油）的(de)培(pei)養基，以壹定的(de)冷卻(que)速度(du)凍存，最終(zhong)保(bao)存於(yu)液(ye)氮中。在(zai)極(ji)低(di)的(de)溫度(du)下(xia)，細(xi)胞(bao)保存的(de)時間(jian)幾(ji)乎是(shi)無(wu)限(xian)的。復(fu)蘇壹般(ban)采用快融方(fang)法(fa)，即(ji)從(cong)液(ye)氮中取(qu)出凍存管(guan)後，立即(ji)放(fang)入(ru)37℃水(shui)中(zhong)，使(shi)之(zhi)在壹分(fen)鐘內迅(xun)速融(rong)解。然後將細(xi)胞(bao)轉(zhuan)入培(pei)養器(qi)皿(min)中進(jin)行(xing)培(pei)養。

二(er)、原代細(xi)胞(bao)分(fen)離

凡是(shi)來(lai)源(yuan)於(yu)胚(pei)胎(tai)、組織(zhi)器(qi)官(guan)及外周血，經特殊分(fen)離方(fang)法(fa)制備而(er)來(lai)的原初培(pei)養的細(xi)胞(bao)稱之(zhi)為(wei)原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)。1懸浮細(xi)胞(bao)的分(fen)離方(fang)法(fa)組織(zhi)材(cai)料若來(lai)自(zi)血液(ye)、羊水(shui)、胸(xiong)水(shui)或(huo)腹水(shui)的(de)懸液(ye)材(cai)料，的方(fang)法(fa)是(shi)采用1000r/min的低(di)速離心10分(fen)鐘。經離心後由(you)於(yu)各(ge)種細(xi)胞(bao)的比(bi)重(zhong)不(bu)同(tong)可(ke)在(zai)分(fen)層(ceng)液(ye)中形(xing)成(cheng)不(bu)同(tong)層(ceng)，這(zhe)樣(yang)可(ke)根(gen)據(ju)需要收(shou)獲(huo)目(mu)的細(xi)胞(bao)。2實體(ti)組織(zhi)材(cai)料的分(fen)離方(fang)法(fa)對於(yu)實體(ti)組織(zhi)材(cai)料，由(you)於(yu)細(xi)胞(bao)間結(jie)合緊(jin)密(mi)，為了(le)使(shi)組織(zhi)中(zhong)的細(xi)胞(bao)充分(fen)分(fen)散(san)，形(xing)成(cheng)細(xi)胞(bao)懸液(ye)，可(ke)采用機械(xie)分(fen)散(san)法(fa)（物理裂解）和(he)消化(hua)分(fen)離法(fa)。

三、細(xi)胞(bao)增殖(zhi)檢測技(ji)術

目(mu)前主要有兩(liang)種用於檢測細(xi)胞(bao)增殖(zhi)能(neng)力的方(fang)法(fa)。壹種是(shi)直接的(de)方(fang)法(fa)，通過直接測定進(jin)行(xing)分(fen)裂

的(de)細(xi)胞(bao)數來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞(bao)的增殖(zhi)能(neng)力。另壹種是(shi)間接(jie)的(de)方(fang)法(fa)，即(ji)細(xi)胞(bao)活(huo)力（cell viability）檢測方(fang)法(fa)，通過檢測樣(yang)品(pin)中(zhong)健康細(xi)胞(bao)的數(shu)目(mu)來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞(bao)的增殖(zhi)能(neng)力。顯然，細(xi)胞(bao)活(huo)力檢測法(fa)並不(bu)能(neng)最終(zhong)證(zheng)明檢測樣(yang)品(pin)中(zhong)的細(xi)胞(bao)是(shi)否在(zai)增殖(zhi)。如細(xi)胞(bao)在某(mou)壹培(pei)養條件下(xia)會(hui)自(zi)發(fa)啟動雕(diao)亡程(cheng)序，但藥物的幹擾(rao)可(ke)抑(yi)制雕(diao)亡的(de)發(fa)生；這時若(ruo)采用細(xi)胞(bao)活(huo)力檢測法(fa)，顯(xian)然(ran)可(ke)以區(qu)分(fen)兩(liang)種條件下(xia)的細(xi)胞(bao)數量(liang)，但(dan)我們並不(bu)能(neng)從藥(yao)物幹擾(rao)組細(xi)胞(bao)數大(da)於(yu)對照(zhao)組的(de)事實說(shuo)明藥物可(ke)促(cu)進(jin)細(xi)胞(bao)增殖(zhi)的(de)結(jie)論。所以最直接的(de)證(zheng)據(ju)應該采用方(fang)法(fa)壹。

取(qu)材(cai)：首先(xian)，用培(pei)養液(ye)濕潤(run)所取(qu)的組織(zhi)材(cai)料，並用鋒(feng)利(li)的眼(yan)科(ke)剪(jian)去除(chu)附在其上(shang)的(de)脂(zhi)肪和(he)結(jie)締組織(zhi)。接(jie)著(zhe)用平(ping)衡(heng)液(ye)（如PBS或(huo)Hanks液(ye)）漂洗，再(zai)用眼(yan)科(ke)彎剪(jian)將組織(zhi)塊(kuai)剪(jian)成(cheng)小塊。多(duo)次(ci)用PBS或(huo)Hanks液(ye)漂洗，直到液(ye)體(ti)清(qing)亮、無(wu)油滴(di)為止。

接(jie)種：用濕潤(run)的吸管吸取(qu)切碎的(de)組織(zhi)塊(kuai)，輕輕吹到培(pei)養瓶皿(min)中，並按壹定間(jian)距(ju)均勻放(fang)在(zai)培(pei)養瓶底(di)壁(bi)上(shang)。註(zhu)意(yi)不(bu)要過多，確(que)保組織(zhi)塊(kuai)切面貼(tie)在培(pei)養瓶底(di)壁(bi)上(shang)。

培(pei)養：將培(pei)養瓶翻轉(zhuan)，使(shi)瓶底(di)朝上(shang)，在(zai)種植了(le)組織(zhi)塊(kuai)壹側(ce)的對側(ce)面加(jia)足培(pei)養液(ye)，避(bi)免(mian)組織(zhi)塊(kuai)與培(pei)養液(ye)接觸(chu)，然後塞緊(jin)瓶塞。將種植了(le)組織(zhi)塊(kuai)的壹側(ce)朝上(shang)，靜(jing)置(zhi)於(yu)37℃培(pei)養箱中(zhong)。待組織(zhi)塊(kuai)貼壁(bi)1到3小時後翻瓶，使(shi)貼(tie)壁(bi)的組織(zhi)塊(kuai)浸(jin)沒在培(pei)養液(ye)中，繼(ji)續(xu)靜(jing)置(zhi)。換(huan)液(ye)：每隔(ge)2到3天(tian)更(geng)換(huan)壹次(ci)培(pei)養液(ye)，或(huo)者根(gen)據(ju)培(pei)養瓶種顏(yan)色(se)的變化(hua)確定換(huan)液(ye)時間(jian)。

壹、原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)計數(shu)

將血球計數(shu)板及蓋片用擦試(shi)幹凈(jing)，並將蓋片蓋在計數(shu)板上(shang)。

將細(xi)胞(bao)懸液(ye)吸出少(shao)許(xu)，滴加(jia)在蓋片邊(bian)緣(yuan)，使(shi)懸液(ye)充滿蓋片和(he)計數(shu)板之間。

靜(jing)置(zhi)3分(fen)鐘。

鏡(jing)下(xia)觀察(cha)，計算計數(shu)板四大格細(xi)胞(bao)總(zong)數，壓(ya)線(xian)細(xi)胞(bao)只計左(zuo)側(ce)和(he)上(shang)方(fang)的。然(ran)後按下(xia)式(shi)計算：

細(xi)胞(bao)數/ml＝4大(da)格細(xi)胞(bao)總(zong)數/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡(jing)下(xia)偶見(jian)由(you)兩(liang)個(ge)以上(shang)細(xi)胞(bao)組成(cheng)的(de)細(xi)胞(bao)團，應按單(dan)個(ge)細(xi)胞(bao)計算，若細(xi)胞(bao)團占10%以上(shang)，說(shuo)明分(fen)散(san)不(bu)好，需重(zhong)新(xin)制備細(xi)胞(bao)懸液(ye)。

二(er)、原代細(xi)胞(bao)活(huo)力

將細(xi)胞(bao)懸液(ye)以0.5ml加(jia)入試管(guan)中。

加(jia)入0.5ml 0.4%臺(tai)盼(pan)蘭染液(ye)，染色(se)2壹3分(fen)鐘。

吸取(qu)少(shao)許(xu)懸液(ye)塗(tu)於(yu)載(zai)玻(bo)片上(shang)，加(jia)上(shang)蓋片。

鏡(jing)下(xia)取(qu)幾個(ge)任(ren)意視野分(fen)別(bie)計死(si)細(xi)胞(bao)和(he)活(huo)細(xi)胞(bao)數，計細(xi)胞(bao)活(huo)力。

死(si)細(xi)胞(bao)能(neng)被(bei)臺(tai)盼(pan)蘭染上(shang)色(se)，鏡下(xia)可(ke)見(jian)深(shen)蘭(lan)色(se)的細(xi)胞(bao)，活(huo)細(xi)胞(bao)不(bu)被(bei)染色(se)，鏡下(xia)呈無(wu)色(se)透明狀。

活(huo)力測定可(ke)以和(he)細(xi)胞(bao)計數(shu)合(he)起來(lai)進(jin)行(xing)，但要考(kao)慮(lv)到染(ran)液(ye)對原(yuan)細(xi)胞(bao)懸液(ye)的加(jia)倍稀釋(shi)作用。