【概(gai)要(yao)描述】兔角(jiao)膜(mo)基(ji)質細(xi)胞的(de)相(xiang)關(guan)產品：SK-HEP-1-LUC人肝(gan)癌細(xi)胞小(xiao)鼠原代(dai)前(qian)列腺上(shang)皮細(xi)胞牛原代(dai)瘤胃上皮(pi)細(xi)胞人(ren)原代(dai)結(jie)直(zhi)腸成(cheng)纖維(wei)細(xi)胞大(da)鼠原代(dai)頸(jing)靜(jing)脈內(nei)皮(pi)細(xi)胞小(xiao)鼠原代(dai)股(gu)骨(gu)頭微(wei)血(xue)管內(nei)皮(pi)細(xi)胞大(da)鼠原代(dai)肌(ji)腱(jian)幹(gan)細(xi)胞小(xiao)鼠原代(dai)成(cheng)纖維(wei)細(xi)胞人(ren)原代(dai)造血(xue)幹細(xi)胞人(ren)原代(dai)脾(pi)成纖維(wei)細(xi)胞

兔角(jiao)膜(mo)基(ji)質細(xi)胞

培(pei)養(yang)基(ji) 含FBS、生長添(tian)加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液(ye)頻率 每(mei)2-3天(tian)換液(ye)壹(yi)次(ci)

生(sheng)長(chang)特性 貼(tie)壁(bi)

細(xi)胞形(xing)態(tai) 成(cheng)纖維(wei)細(xi)胞樣(yang)

傳代(dai)特性 可傳5代(dai)左右(you)；3代(dai)以(yi)內(nei)狀(zhuang)態(tai)

消化(hua)液(ye) 0.25%yi蛋(dan)白酶(mei)

培(pei)養(yang)條(tiao)件 氣(qi)相(xiang)：空氣(qi)，95%；CO2，5%

兔角(jiao)膜(mo)基(ji)質分(fen)離(li)自(zi)眼(yan)角(jiao)膜(mo)組織；角(jiao)膜(mo)位於(yu)眼(yan)球(qiu)前(qian)壁(bi)的(de)壹(yi)層透明膜(mo)，約占(zhan)纖維(wei)膜(mo)的(de)前(qian)1/6，從(cong)後(hou)面(mian)看(kan)角(jiao)膜(mo)呈正(zheng)圓(yuan)形，從(cong)前(qian)面(mian)看(kan)為橫(heng)橢(tuo)圓(yuan)形。角(jiao)膜(mo)厚(hou)度各(ge)部分(fen)不(bu)盡相(xiang)同(tong)，中(zhong)央部最(zui)薄。角(jiao)膜(mo)有十(shi)分(fen)敏(min)感(gan)的(de)神(shen)經末梢，如有外(wai)物(wu)接(jie)觸(chu)角(jiao)膜(mo)，眼(yan)瞼便會不由自(zi)主地合上以(yi)保(bao)護(hu)眼(yan)睛(jing)。為了保(bao)持透明，角(jiao)膜(mo)並(bing)沒(mei)有血(xue)管，透過外界(jie)空氣(qi)、淚(lei)液(ye)及房水獲取養(yang)份(fen)及氧氣(qi)。角(jiao)膜(mo)分(fen)為(wei)五(wu)層，由前(qian)向後(hou)依(yi)次(ci)為：上皮(pi)細(xi)胞層、前(qian)彈力層、基(ji)質層、後(hou)彈力層、內(nei)皮(pi)細(xi)胞層。角(jiao)膜(mo)基(ji)質層是(shi)角(jiao)膜(mo)的(de)主要組成部分(fen)，占(zhan)據角(jiao)膜(mo)厚(hou)度的(de)90%，由角(jiao)膜(mo)基(ji)質細(xi)胞、膠原纖維(wei)和(he)細(xi)胞外(wai)基(ji)質構(gou)成(cheng)。角(jiao)膜(mo)基(ji)質層缺(que)損的(de)修(xiu)復(fu)主要由角(jiao)膜(mo)基(ji)質細(xi)胞的(de)增(zeng)殖(zhi)及分(fen)泌細(xi)胞外(wai)基(ji)質完(wan)成。角(jiao)膜(mo)基(ji)質層具有(you)結(jie)構(gou)規(gui)整，透明度(du)高(gao)的(de)特點(dian)，正(zheng)常(chang)情(qing)況(kuang)下角(jiao)膜(mo)基(ji)質細(xi)胞分(fen)泌組成基(ji)質層的(de)成(cheng)分(fen)，維(wei)持角(jiao)膜(mo)的(de)透明度(du)，此(ci)細(xi)胞對(dui)於(yu)角(jiao)膜(mo)損傷(shang)的(de)修(xiu)復(fu)具有(you)重要意義。角(jiao)膜(mo)基(ji)質細(xi)胞，存在於(yu)角(jiao)膜(mo)基(ji)質層中(zhong)，在正(zheng)常(chang)情(qing)況(kuang)下，處(chu)於(yu)靜(jing)止(zhi)狀(zhuang)態(tai)。但(dan)當角(jiao)膜(mo)損傷(shang)時，不(bu)同上皮來(lai)源的(de)因(yin)子及環境(jing)信號(hao)，將(jiang)影(ying)響(xiang)角(jiao)膜(mo)基(ji)質細(xi)胞的(de)應(ying)答(da)反(fan)應，決定著角(jiao)膜(mo)能否(fou)wan全(quan)被修(xiu)復。
方法簡(jian)介(jie)：

公(gong)司實(shi)驗室分(fen)離(li)的(de)兔角(jiao)膜(mo)基(ji)質采(cai)用混(hun)合膠原酶(mei)消化(hua)法制(zhi)備(bei)而(er)來(lai)，細(xi)胞總(zong)量(liang)約(yue)為(wei)5×10?cells/瓶。
質量檢(jian)測：

公(gong)司實(shi)驗室分(fen)離(li)的(de)兔角(jiao)膜(mo)基(ji)質經Vimentin免疫熒(ying)光鑒(jian)定，純(chun)度(du)可達(da)90%以(yi)上(shang)，且(qie)不含有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原體、細(xi)菌、酵(jiao)母和(he)真菌等(deng)。

壹(yi)、細(xi)胞培(pei)養(yang)

1取材 在無(wu)菌環(huan)境(jing)下從(cong)機體(ti)取出某(mou)種(zhong)組織細(xi)胞（視(shi)實(shi)驗目的(de)而(er)定），經過壹(yi)定的(de)處(chu)理(li)（如(ru)消化(hua)分(fen)散細(xi)胞、分(fen)離(li)等(deng)）後(hou)接(jie)入(ru)培(pei)養(yang)器(qi)血(xue)中(zhong)，這壹(yi)過程稱為(wei)取材。如是(shi)細(xi)胞株(zhu)的(de)擴大培(pei)養(yang)則(ze)無(wu)取材這壹(yi)過程。機體取出的(de)組織細(xi)胞的(de)培(pei)養(yang)稱為(wei)原代(dai)培(pei)養(yang)。2培(pei)養(yang) 將(jiang)取得(de)的(de)組織細(xi)胞接(jie)入(ru)培(pei)養(yang)瓶(ping)或培(pei)養(yang)板(ban)中(zhong)的(de)過程稱為(wei)培(pei)養(yang)。3凍(dong)存及復蘇(su)（可參閱後(hou)面(mian)有(you)關章節）為了保(bao)存細(xi)胞，特別(bie)是(shi)不(bu)易(yi)獲得(de)的(de)突(tu)變(bian)型細(xi)胞或(huo)細(xi)胞株(zhu)，要(yao)將細(xi)胞凍(dong)存。凍(dong)存的(de)溫(wen)度壹(yi)般(ban)用液(ye)氮(dan)的(de)溫(wen)度－196℃，將細(xi)胞收(shou)集(ji)至凍(dong)存管中(zhong)加入(ru)含保(bao)護(hu)劑(ji)（壹(yi)般(ban)為二甲(jia)亞碸或(huo)甘(gan)油(you)）的(de)培(pei)養(yang)基(ji)，以(yi)壹(yi)定的(de)冷卻速度凍(dong)存，最(zui)終(zhong)保(bao)存於液(ye)氮(dan)中(zhong)。在極低(di)的(de)溫(wen)度下，細(xi)胞保(bao)存的(de)時間(jian)幾(ji)乎(hu)是(shi)無(wu)限的(de)。復(fu)蘇(su)壹(yi)般(ban)采(cai)用快(kuai)融方法，即(ji)從(cong)液(ye)氮(dan)中(zhong)取出凍(dong)存管後(hou)，立即(ji)放(fang)入37℃水中(zhong)，使(shi)之在(zai)壹(yi)分(fen)鐘(zhong)內(nei)迅速融解。然後(hou)將細(xi)胞轉入(ru)培(pei)養(yang)器(qi)皿中(zhong)進行(xing)培(pei)養(yang)。

二、原代(dai)細(xi)胞分(fen)離(li)

凡是(shi)來(lai)源於(yu)胚胎、組織器(qi)官(guan)及外周(zhou)血(xue)，經特殊分(fen)離(li)方法制(zhi)備(bei)而(er)來(lai)的(de)原初(chu)培(pei)養(yang)的(de)細(xi)胞稱之(zhi)為(wei)原代(dai)細(xi)胞。1懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞的(de)分(fen)離(li)方法組織材料(liao)若來(lai)自(zi)血(xue)液(ye)、羊水、胸(xiong)水或腹(fu)水的(de)懸(xuan)液(ye)材料(liao)，的(de)方法是(shi)采(cai)用1000r/min的(de)低(di)速離(li)心10分(fen)鐘(zhong)。經離(li)心後(hou)由於各種(zhong)細(xi)胞的(de)比重不同可在分(fen)層液(ye)中(zhong)形成(cheng)不同(tong)層，這(zhe)樣可根據需要收(shou)獲目的(de)細(xi)胞。2實(shi)體組織材料(liao)的(de)分(fen)離(li)方法對(dui)於(yu)實(shi)體組織材料(liao)，由於細(xi)胞間(jian)結(jie)合緊(jin)密(mi)，為(wei)了使(shi)組織中(zhong)的(de)細(xi)胞充(chong)分(fen)分(fen)散，形(xing)成細(xi)胞懸(xuan)液(ye)，可采(cai)用機(ji)械(xie)分(fen)散法（物(wu)理(li)裂解）和(he)消化(hua)分(fen)離(li)法。

三(san)、細(xi)胞增(zeng)殖(zhi)檢(jian)測技術

目(mu)前(qian)主要有(you)兩(liang)種(zhong)用於檢(jian)測細(xi)胞增(zeng)殖(zhi)能力的(de)方法。壹(yi)種(zhong)是(shi)直(zhi)接(jie)的(de)方法，通(tong)過直接(jie)測定進行(xing)分(fen)裂

的(de)細(xi)胞數(shu)來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞的(de)增(zeng)殖(zhi)能(neng)力。另(ling)壹(yi)種(zhong)是(shi)間(jian)接(jie)的(de)方法，即(ji)細(xi)胞活(huo)力（cell viability）檢(jian)測方法，通(tong)過檢(jian)測樣品中(zhong)健康細(xi)胞的(de)數(shu)目來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞的(de)增(zeng)殖(zhi)能(neng)力。顯然，細(xi)胞活(huo)力檢(jian)測法並(bing)不(bu)能(neng)最(zui)終(zhong)證(zheng)明檢(jian)測樣品中(zhong)的(de)細(xi)胞是(shi)否(fou)在增(zeng)殖。如(ru)細(xi)胞在(zai)某(mou)壹(yi)培(pei)養(yang)條(tiao)件下會自(zi)發(fa)啟(qi)動(dong)雕亡(wang)程序(xu)，但藥物的(de)幹(gan)擾可抑制雕亡(wang)的(de)發(fa)生；這(zhe)時若(ruo)采(cai)用細(xi)胞活(huo)力檢(jian)測法，顯(xian)然(ran)可以(yi)區(qu)分(fen)兩(liang)種(zhong)條件下的(de)細(xi)胞數(shu)量，但(dan)我們並(bing)不(bu)能(neng)從(cong)藥物幹(gan)擾組細(xi)胞數(shu)大於(yu)對(dui)照(zhao)組的(de)事(shi)實(shi)說明藥物可促進細(xi)胞增(zeng)殖(zhi)的(de)結(jie)論(lun)。所(suo)以(yi)最(zui)直接(jie)的(de)證(zheng)據應(ying)該(gai)采(cai)用方法壹(yi)。

取材：首(shou)先，用(yong)培(pei)養(yang)液(ye)濕(shi)潤(run)所(suo)取的(de)組織材料(liao)，並(bing)用(yong)鋒利(li)的(de)眼(yan)科(ke)剪(jian)去(qu)除(chu)附(fu)在其上的(de)脂(zhi)肪(fang)和(he)結締(di)組織。接(jie)著用平(ping)衡(heng)液(ye)（如PBS或Hanks液(ye)）漂(piao)洗(xi)，再用眼(yan)科(ke)彎剪(jian)將(jiang)組織塊(kuai)剪(jian)成(cheng)小塊(kuai)。多次用(yong)PBS或Hanks液(ye)漂(piao)洗(xi)，直到液(ye)體清(qing)亮、無(wu)油(you)滴為(wei)止(zhi)。

接(jie)種(zhong)：用濕(shi)潤(run)的(de)吸(xi)管(guan)吸(xi)取切(qie)碎(sui)的(de)組織塊(kuai)，輕輕吹(chui)到培(pei)養(yang)瓶(ping)皿中(zhong)，並(bing)按(an)壹(yi)定間距(ju)均(jun)勻放(fang)在培(pei)養(yang)瓶(ping)底壁(bi)上(shang)。註(zhu)意(yi)不(bu)要過多，確保(bao)組織塊(kuai)切(qie)面(mian)貼(tie)在培(pei)養(yang)瓶(ping)底壁(bi)上(shang)。

培(pei)養(yang)：將(jiang)培(pei)養(yang)瓶(ping)翻(fan)轉，使(shi)瓶底朝上，在種(zhong)植了組織塊(kuai)壹(yi)側的(de)對(dui)側面(mian)加(jia)足(zu)培(pei)養(yang)液(ye)，避(bi)免組織塊(kuai)與(yu)培(pei)養(yang)液(ye)接(jie)觸(chu)，然(ran)後(hou)塞(sai)緊(jin)瓶(ping)塞(sai)。將(jiang)種(zhong)植了組織塊(kuai)的(de)壹(yi)側朝上，靜(jing)置於(yu)37℃培(pei)養(yang)箱(xiang)中(zhong)。待(dai)組織塊(kuai)貼(tie)壁(bi)1到3小(xiao)時後(hou)翻(fan)瓶(ping)，使(shi)貼壁(bi)的(de)組織塊(kuai)浸(jin)沒(mei)在培(pei)養(yang)液(ye)中(zhong)，繼續靜(jing)置。換液(ye)：每隔(ge)2到3天(tian)更換壹(yi)次(ci)培(pei)養(yang)液(ye)，或者根據培(pei)養(yang)瓶(ping)種(zhong)顏色(se)的(de)變(bian)化(hua)確定換液(ye)時間(jian)。

壹(yi)、原代(dai)細(xi)胞計(ji)數(shu)

將血(xue)球計數(shu)板及蓋(gai)片用擦(ca)試幹(gan)凈(jing)，並(bing)將(jiang)蓋(gai)片蓋(gai)在計數(shu)板上(shang)。

將細(xi)胞懸(xuan)液(ye)吸(xi)出少許(xu)，滴加在(zai)蓋(gai)片邊(bian)緣(yuan)，使(shi)懸液(ye)充(chong)滿蓋(gai)片和(he)計數(shu)板之(zhi)間。

靜(jing)置3分(fen)鐘(zhong)。

鏡(jing)下觀(guan)察，計(ji)算計(ji)數(shu)板四(si)大格細(xi)胞總(zong)數(shu)，壓線細(xi)胞只(zhi)計左側和(he)上方的(de)。然(ran)後(hou)按下式(shi)計(ji)算(suan)：

細(xi)胞數(shu)/ml＝4大格細(xi)胞總(zong)數(shu)/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡(jing)下偶(ou)見由兩(liang)個(ge)以(yi)上(shang)細(xi)胞組成的(de)細(xi)胞團，應按單個(ge)細(xi)胞計(ji)算(suan)，若細(xi)胞團占10%以(yi)上(shang)，說(shuo)明分(fen)散不(bu)好，需重新制備(bei)細(xi)胞懸(xuan)液(ye)。

二、原代(dai)細(xi)胞活(huo)力

將細(xi)胞懸(xuan)液(ye)以(yi)0.5ml加(jia)入(ru)試管(guan)中(zhong)。

加入(ru)0.5ml 0.4%臺盼蘭染液(ye)，染色(se)2壹(yi)3分(fen)鐘(zhong)。

吸(xi)取少許(xu)懸液(ye)塗於(yu)載(zai)玻(bo)片上(shang)，加(jia)上(shang)蓋(gai)片。

鏡(jing)下取幾(ji)個(ge)任意視(shi)野分(fen)別(bie)計死細(xi)胞和(he)活細(xi)胞數(shu)，計細(xi)胞活(huo)力。

死細(xi)胞能(neng)被(bei)臺盼(pan)蘭染上(shang)色(se)，鏡(jing)下可見深蘭色(se)的(de)細(xi)胞，活(huo)細(xi)胞不(bu)被(bei)染色(se)，鏡(jing)下呈無(wu)色(se)透明狀(zhuang)。

活力測定可以(yi)和(he)細(xi)胞計(ji)數(shu)合起來(lai)進行(xing)，但(dan)要考(kao)慮(lv)到染液(ye)對(dui)原細(xi)胞懸(xuan)液(ye)的(de)加(jia)倍(bei)稀(xi)釋(shi)作用(yong)。