【概(gai)要(yao)描(miao)述】兔乳腺成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)的相(xiang)關(guan)產(chan)品(pin)：Hep 3B2.1-7人(ren)肝(gan)癌(ai)細胞(bao)人(ren)原(yuan)代子宮內膜(mo)幹(gan)細(xi)胞(bao)小鼠原(yuan)代牙(ya)齦成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)人(ren)原(yuan)代直(zhi)腸(chang)平(ping)滑肌(ji)細(xi)胞(bao)羊(yang)原(yuan)代臍(qi)帶(dai)間充(chong)質幹(gan)細(xi)胞(bao)大(da)鼠原(yuan)代子宮蛻膜基質細(xi)胞(bao)大(da)鼠原(yuan)代骨骼肌(ji)細(xi)胞(bao)小鼠原(yuan)代肺(fei)成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)人(ren)原(yuan)代前脂肪細(xi)胞(bao)兔(tu)原(yuan)代前列腺(xian)基底(di)細胞(bao)

兔(tu)乳腺成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)

培(pei)養(yang)基 含(han)FBS、生(sheng)長(chang)添加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等

換(huan)液(ye)頻(pin)率 每(mei)2-3天(tian)換(huan)液壹(yi)次(ci)

生(sheng)長(chang)特(te)性 貼(tie)壁(bi)

細(xi)胞(bao)形(xing)態 成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)樣(yang)

傳代特(te)性 可(ke)傳5代左(zuo)右；3代以(yi)內狀(zhuang)態(tai)

消(xiao)化(hua)液 0.25%yi蛋(dan)白酶

培(pei)養(yang)條(tiao)件 氣(qi)相：空(kong)氣(qi)，95%；CO2，5%

兔(tu)乳腺成(cheng)纖維分(fen)離(li)自(zi)乳腺組織；乳腺位(wei)於皮下(xia)淺(qian)筋(jin)膜的淺(qian)層與深層之間(jian)，淺(qian)筋(jin)膜伸(shen)向乳腺組織內形(xing)成條(tiao)索狀(zhuang)的小葉(ye)間隔(ge)，壹(yi)端(duan)連(lian)於胸(xiong)肌(ji)筋(jin)膜，另壹(yi)端(duan)連(lian)於皮膚(fu)，將乳腺腺(xian)體(ti)固定(ding)在(zai)胸(xiong)部的皮下(xia)組織之(zhi)中。乳腺是(shi)哺(bu)乳動物(wu)少(shao)數可(ke)以(yi)重(zhong)復(fu)經(jing)歷生長(chang)、功(gong)能(neng)分(fen)化(hua)和退化(hua)過(guo)程(cheng)的器(qi)官(guan)之壹(yi)。纖維結(jie)締(di)組織伸(shen)入乳腺組織之(zhi)間，形(xing)成許(xu)多(duo)間(jian)隔(ge)，這(zhe)些(xie)纖維結(jie)締(di)組織對(dui)乳房起(qi)固定(ding)作(zuo)用，而纖維結(jie)締(di)組織是(shi)由(you)成纖維細(xi)胞(bao)構成的。成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)（Fibroblast）是(shi)疏(shu)松結(jie)締(di)組織的主(zhu)要(yao)細(xi)胞(bao)成(cheng)分(fen)，由(you)胚胎時期(qi)的間(jian)充(chong)質(zhi)細(xi)胞(bao)分(fen)化(hua)而來。成纖維細(xi)胞(bao)較大(da)，輪廓清(qing)楚(chu)，多(duo)為突(tu)起(qi)的紡(fang)錘(chui)形(xing)或(huo)星(xing)形(xing)的扁(bian)平(ping)狀(zhuang)結(jie)構，其細胞(bao)核(he)呈規則的卵圓形(xing)，核(he)仁(ren)大(da)而明顯。成纖維細(xi)胞(bao)功(gong)能(neng)活動旺盛(sheng)，細胞(bao)質(zhi)嗜(shi)弱(ruo)堿性，具明(ming)顯的蛋(dan)白質合成(cheng)和分(fen)泌(mi)活(huo)動，在壹(yi)定(ding)條(tiao)件下，它可(ke)以(yi)實現(xian)跟纖維細(xi)胞(bao)的互(hu)相(xiang)轉(zhuan)化(hua)；成纖維細(xi)胞(bao)對(dui)不同程(cheng)度(du)的細(xi)胞(bao)變性、壞死和組織缺損的修(xiu)復(fu)有(you)著十分(fen)重(zhong)要(yao)的作(zuo)用。剛分(fen)離(li)的乳腺成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)呈(cheng)圓(yuan)形(xing)、折光(guang)性良(liang)好，懸(xuan)浮(fu)於培養(yang)基中。30min細(xi)胞(bao)貼(tie)壁(bi)，其中(zhong)部分(fen)開始(shi)伸出(chu)偽(wei)足(zu)，表現為小的突(tu)起(qi)；6h後(hou)細胞(bao)基本貼(tie)壁wan全(quan)，伸(shen)展成梭形(xing)，胞(bao)核(he)清晰，分(fen)布較均(jun)勻(yun)，散(san)在(zai)生(sheng)長(chang)，不聚(ju)集(ji)成(cheng)團；細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)迅速(su)，5-7天(tian)即(ji)呈(cheng)融合狀(zhuang)態(tai)，細胞(bao)排(pai)列(lie)緊(jin)密(mi)，有的交(jiao)叉重(zhong)疊生(sheng)長(chang)，平(ping)坦(tan)、胞(bao)體(ti)較大(da)，細胞(bao)質(zhi)透(tou)明，細(xi)胞(bao)核(he)較大(da)，呈橢圓形(xing)，顏色(se)淡(dan)。細(xi)胞(bao)融合，並彼(bi)此(ci)連(lian)接(jie)成網狀(zhuang)；細(xi)胞(bao)呈(cheng)突(tu)起(qi)的紡(fang)錘(chui)形(xing)或(huo)星(xing)形(xing)的扁(bian)平(ping)分(fen)布。
方(fang)法(fa)簡介：

公司實驗室(shi)分(fen)離(li)的兔(tu)乳腺成(cheng)纖維采用yi蛋(dan)白酶-膠(jiao)原(yuan)酶混合消(xiao)化(hua)法結(jie)合差(cha)速貼(tie)壁法制備(bei)而來，細胞(bao)總(zong)量約(yue)為5×10?cells/瓶。
質(zhi)量(liang)檢(jian)測：

公司實驗室(shi)分(fen)離(li)的兔(tu)乳腺成(cheng)纖維經(jing)Vimentin免疫熒(ying)光(guang)鑒(jian)定(ding)，純度可(ke)達(da)90%以(yi)上(shang)，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原(yuan)體、細(xi)菌、酵(jiao)母(mu)和真(zhen)菌(jun)等(deng)。

壹(yi)、細胞(bao)培(pei)養(yang)

1取材 在無(wu)菌環(huan)境(jing)下(xia)從機(ji)體取出某種組織細(xi)胞(bao)（視實驗目的而定(ding)），經(jing)過(guo)壹(yi)定(ding)的處(chu)理(li)（如(ru)消(xiao)化(hua)分(fen)散(san)細(xi)胞(bao)、分(fen)離(li)等(deng)）後接(jie)入培養(yang)器(qi)血中，這壹(yi)過(guo)程(cheng)稱為取材。如是(shi)細(xi)胞(bao)株(zhu)的擴(kuo)大(da)培(pei)養(yang)則無(wu)取材這壹(yi)過(guo)程(cheng)。機(ji)體取出的組織細(xi)胞(bao)的培(pei)養(yang)稱為原代培(pei)養(yang)。2培(pei)養(yang) 將取得的組織細(xi)胞(bao)接(jie)入培養(yang)瓶(ping)或(huo)培(pei)養(yang)板中(zhong)的過(guo)程(cheng)稱為培養(yang)。3凍存及復(fu)蘇(su)（可(ke)參(can)閱(yue)後(hou)面(mian)有(you)關(guan)章(zhang)節(jie)）為了保存細(xi)胞(bao)，特(te)別(bie)是不易獲得的突(tu)變型(xing)細胞(bao)或(huo)細(xi)胞(bao)株(zhu)，要(yao)將細(xi)胞(bao)凍存。凍存的溫(wen)度壹(yi)般(ban)用液(ye)氮的溫(wen)度－196℃，將細(xi)胞(bao)收集(ji)至(zhi)凍存管中(zhong)加入(ru)含保護(hu)劑(ji)（壹(yi)般(ban)為二甲亞碸或(huo)甘(gan)油）的培(pei)養(yang)基，以(yi)壹(yi)定(ding)的冷(leng)卻速(su)度(du)凍存，最(zui)終(zhong)保存於液氮中。在極(ji)低(di)的溫(wen)度下，細(xi)胞(bao)保存的時(shi)間(jian)幾(ji)乎(hu)是(shi)無(wu)限(xian)的。復(fu)蘇(su)壹(yi)般(ban)采用快(kuai)融方法，即(ji)從(cong)液氮中取出凍存管後(hou)，立(li)即(ji)放(fang)入37℃水中，使(shi)之在(zai)壹(yi)分(fen)鐘(zhong)內迅速(su)融解。然後將細(xi)胞(bao)轉(zhuan)入(ru)培(pei)養(yang)器(qi)皿中(zhong)進(jin)行培養(yang)。

二、原(yuan)代細(xi)胞(bao)分(fen)離(li)

凡(fan)是(shi)來源(yuan)於胚胎、組織器(qi)官(guan)及外周血，經(jing)特(te)殊分(fen)離(li)方(fang)法制(zhi)備(bei)而來的原(yuan)初(chu)培(pei)養(yang)的細(xi)胞(bao)稱之為原代細(xi)胞(bao)。1懸(xuan)浮(fu)細胞(bao)的分(fen)離(li)方(fang)法組織材料若來自血液、羊(yang)水、胸(xiong)水或(huo)腹(fu)水的懸(xuan)液(ye)材料，的方(fang)法(fa)是(shi)采用1000r/min的低(di)速(su)離(li)心(xin)10分(fen)鐘(zhong)。經(jing)離心(xin)後(hou)由(you)於各種細胞(bao)的比(bi)重(zhong)不同可(ke)在(zai)分(fen)層液中(zhong)形(xing)成不同層，這樣(yang)可(ke)根(gen)據需要(yao)收獲(huo)目的細(xi)胞(bao)。2實(shi)體(ti)組織材料的分(fen)離(li)方(fang)法對(dui)於實體(ti)組織材料，由(you)於細胞(bao)間(jian)結(jie)合緊(jin)密(mi)，為了使(shi)組織中(zhong)的細(xi)胞(bao)充(chong)分(fen)分(fen)散(san)，形(xing)成細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)，可(ke)采用機(ji)械分(fen)散(san)法(fa)（物(wu)理裂(lie)解(jie)）和消(xiao)化(hua)分(fen)離(li)法(fa)。

三(san)、細(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)檢(jian)測技術(shu)

目前主要(yao)有(you)兩種用於檢(jian)測細(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)能(neng)力(li)的方(fang)法(fa)。壹(yi)種是直(zhi)接(jie)的方(fang)法(fa)，通過(guo)直(zhi)接(jie)測定(ding)進(jin)行分(fen)裂(lie)

的細(xi)胞(bao)數(shu)來評價細胞(bao)的增(zeng)殖(zhi)能(neng)力(li)。另壹(yi)種是間接(jie)的方(fang)法(fa)，即(ji)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)（cell viability）檢(jian)測方(fang)法(fa)，通過(guo)檢(jian)測樣(yang)品(pin)中(zhong)健康細(xi)胞(bao)的數(shu)目來評價細胞(bao)的增(zeng)殖(zhi)能(neng)力(li)。顯然，細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢(jian)測法(fa)並不能最(zui)終(zhong)證明檢(jian)測樣(yang)品(pin)中(zhong)的細(xi)胞(bao)是(shi)否(fou)在增(zeng)殖(zhi)。如(ru)細(xi)胞(bao)在(zai)某(mou)壹(yi)培養(yang)條(tiao)件下會自發(fa)啟(qi)動雕亡(wang)程序(xu)，但藥物(wu)的幹(gan)擾(rao)可(ke)抑(yi)制(zhi)雕(diao)亡(wang)的發(fa)生(sheng)；這(zhe)時(shi)若(ruo)采用細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢(jian)測法(fa)，顯然可(ke)以(yi)區分(fen)兩(liang)種條件下的細(xi)胞(bao)數(shu)量(liang)，但我們並不能從藥物(wu)幹(gan)擾(rao)組細胞(bao)數(shu)大(da)於對照組的事實說(shuo)明藥物(wu)可(ke)促(cu)進(jin)細胞(bao)增(zeng)殖(zhi)的結(jie)論(lun)。所以(yi)最(zui)直(zhi)接(jie)的證據應(ying)該(gai)采用方(fang)法(fa)壹(yi)。

取材：首先(xian)，用培(pei)養(yang)液(ye)濕(shi)潤(run)所取的組織材料，並用鋒(feng)利(li)的眼(yan)科剪(jian)去除(chu)附(fu)在其上(shang)的脂(zhi)肪和結(jie)締(di)組織。接(jie)著用平(ping)衡(heng)液(ye)（如(ru)PBS或(huo)Hanks液(ye)）漂(piao)洗(xi)，再用眼(yan)科彎(wan)剪將組織塊剪成(cheng)小塊。多(duo)次(ci)用PBS或(huo)Hanks液(ye)漂(piao)洗(xi)，直(zhi)到(dao)液體清亮(liang)、無(wu)油滴(di)為止(zhi)。

接(jie)種：用濕(shi)潤(run)的吸(xi)管吸(xi)取切碎的組織塊，輕輕(qing)吹(chui)到培養(yang)瓶(ping)皿中(zhong)，並按壹(yi)定(ding)間(jian)距(ju)均(jun)勻(yun)放(fang)在(zai)培(pei)養(yang)瓶(ping)底(di)壁上(shang)。註意不要(yao)過(guo)多(duo)，確保組織塊切面貼(tie)在(zai)培養(yang)瓶(ping)底(di)壁上(shang)。

培(pei)養(yang)：將培(pei)養(yang)瓶(ping)翻轉(zhuan)，使(shi)瓶底(di)朝上(shang)，在種植了組織塊壹(yi)側(ce)的對(dui)側(ce)面(mian)加足培養(yang)液(ye)，避免組織塊與培養(yang)液(ye)接(jie)觸，然後塞緊(jin)瓶塞(sai)。將種植了組織塊的壹(yi)側(ce)朝(chao)上(shang)，靜置(zhi)於37℃培養(yang)箱(xiang)中。待組織塊貼壁(bi)1到(dao)3小時後(hou)翻瓶(ping)，使(shi)貼壁(bi)的組織塊浸沒(mei)在(zai)培養(yang)液(ye)中，繼續靜置(zhi)。換液(ye)：每(mei)隔(ge)2到(dao)3天(tian)更換(huan)壹(yi)次(ci)培(pei)養(yang)液(ye)，或(huo)者(zhe)根(gen)據培養(yang)瓶(ping)種顏色的變化(hua)確定(ding)換(huan)液(ye)時(shi)間。

壹(yi)、原代細(xi)胞(bao)計數

將血(xue)球計數板及蓋片用擦試(shi)幹(gan)凈(jing)，並將蓋片蓋在計數板上(shang)。

將細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)吸(xi)出(chu)少(shao)許(xu)，滴(di)加在(zai)蓋片邊(bian)緣，使(shi)懸(xuan)液(ye)充(chong)滿(man)蓋片和計數板之(zhi)間。

靜置(zhi)3分(fen)鐘(zhong)。

鏡(jing)下(xia)觀察(cha)，計算計數板四(si)大格(ge)細(xi)胞(bao)總(zong)數，壓(ya)線(xian)細胞(bao)只(zhi)計左側(ce)和上(shang)方的。然(ran)後(hou)按(an)下(xia)式(shi)計算：

細(xi)胞(bao)數(shu)/ml＝4大(da)格(ge)細(xi)胞(bao)總(zong)數/ 4×10000

註意：鏡(jing)下(xia)偶(ou)見(jian)由(you)兩個(ge)以(yi)上(shang)細胞(bao)組成的細(xi)胞(bao)團，應(ying)按(an)單個細(xi)胞(bao)計算，若(ruo)細(xi)胞(bao)團占(zhan)10%以(yi)上(shang)，說明(ming)分(fen)散(san)不好，需(xu)重(zhong)新(xin)制備(bei)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)。

二、原(yuan)代細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)

將細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)以(yi)0.5ml加入(ru)試管中(zhong)。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺盼(pan)蘭染液(ye)，染(ran)色2壹(yi)3分(fen)鐘(zhong)。

吸(xi)取少(shao)許(xu)懸(xuan)液(ye)塗於載玻(bo)片上(shang)，加上(shang)蓋片。

鏡(jing)下(xia)取幾個任(ren)意(yi)視野分(fen)別(bie)計死細胞(bao)和活細胞(bao)數(shu)，計細胞(bao)活(huo)力(li)。

死細胞(bao)能(neng)被臺盼(pan)蘭染上(shang)色，鏡(jing)下可(ke)見(jian)深(shen)蘭色的細(xi)胞(bao)，活(huo)細(xi)胞(bao)不被染色(se)，鏡(jing)下呈無(wu)色透(tou)明(ming)狀(zhuang)。

活(huo)力(li)測定(ding)可(ke)以(yi)和細胞(bao)計數合起(qi)來進(jin)行，但要(yao)考(kao)慮到染液(ye)對(dui)原(yuan)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)的加(jia)倍(bei)稀(xi)釋作用。