【概要(yao)描(miao)述(shu)】兔骨髓單(dan)核(he)細胞(bao)的相關(guan)產(chan)品：A549/DDP/LUC (STR)人肺(fei)腺(xian)癌耐(nai)株帶(dai)熒(ying)光酶兔原(yuan)代脂肪細胞(bao)大(da)鼠原(yuan)代脊(ji)髓微(wei)血(xue)管(guan)內皮細胞(bao)小(xiao)鼠原(yuan)代(dai)鞏(gong)膜(mo)成纖維細胞(bao)人原(yuan)代骨骼肌(ji)成纖維細胞(bao)小(xiao)鼠原(yuan)代(dai)腦(nao)膜(mo)細胞(bao)大(da)鼠原(yuan)代耳(er)軟骨細胞(bao)大(da)鼠原(yuan)代大(da)隱靜脈內皮細胞(bao)大(da)鼠原(yuan)代骨髓單(dan)核(he)細胞(bao)大(da)鼠原(yuan)代胚胎(tai)成纖維細胞(bao)

兔骨髓單(dan)核(he)細胞(bao)

培(pei)養基 含FBS、生長添加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液壹(yi)次

生長特(te)性 貼壁

細胞(bao)形(xing)態(tai) 巨噬細胞(bao)樣(yang)

傳代特(te)性 不(bu)增(zeng)殖(zhi)；不(bu)傳代

消化(hua)液 0.25%yi蛋白(bai)酶

培(pei)養條件 氣(qi)相：空(kong)氣(qi)，95%；CO2，5%

兔骨髓單(dan)核(he)分(fen)離(li)自(zi)骨髓；骨髓是(shi)機(ji)體的(de)造血(xue)組(zu)織，位(wei)於身(shen)體(ti)的許(xu)多骨骼內。成年動(dong)物(wu)的(de)骨髓分(fen)兩(liang)種：紅骨髓和黃(huang)骨髓。紅骨髓能(neng)制(zhi)造紅細胞(bao)、血(xue)小(xiao)板(ban)和各種白(bai)細胞(bao)。血(xue)小(xiao)板(ban)有止(zhi)血(xue)作(zuo)用(yong)，白(bai)細胞(bao)能(neng)殺滅與抑(yi)制(zhi)各種病原(yuan)體，包括(kuo)細菌、病毒(du)等；某(mou)些(xie)淋(lin)巴細胞(bao)能(neng)制(zhi)造抗(kang)體。因(yin)此(ci)，骨髓不(bu)但是(shi)造血(xue)器(qi)官，它還(hai)是(shi)重(zhong)要(yao)的免疫(yi)器官(guan)。骨髓是(shi)存在(zai)於長骨（如肱(gong)骨、股骨）的骨髓腔和扁(bian)平骨（如髂骨）的稀(xi)松骨質間(jian)的網(wang)眼中，是(shi)壹(yi)種海綿狀(zhuang)的組(zu)織，能(neng)產(chan)生血(xue)細胞(bao)的骨髓略呈(cheng)紅色(se)，稱為(wei)紅(hong)骨髓。出生時(shi)，紅(hong)骨髓充滿(man)全身(shen)骨髓腔，隨著年(nian)齡增(zeng)大(da)，脂肪細胞(bao)增(zeng)多(duo)，相當部分(fen)紅(hong)骨髓被黃(huang)骨髓取(qu)代，最後幾(ji)乎(hu)只有(you)扁(bian)平骨骨髓腔中有紅骨髓。骨髓單(dan)核(he)細胞(bao)是(shi)壹(yi)種未(wei)成熟的(de)單(dan)核(he)細胞(bao)，在(zai)骨髓細胞(bao)中約(yue)占0.04%，被認為是(shi)破(po)骨細胞(bao)的前體(ti)細胞(bao)，較(jiao)外周血(xue)單(dan)個(ge)核(he)細胞(bao)誘導的破(po)骨細胞(bao)得率高、全骨髓誘導法產(chan)生的(de)破(po)骨細胞(bao)數量(liang)多，純度高，較(jiao)脾細胞(bao)誘導法分(fen)化(hua)效率高。骨髓單(dan)核(he)細胞(bao)（BMMNCs）是(shi)從股骨或脛(jing)骨骨髓中分(fen)離(li)提取(qu)出來(lai)的原代細胞(bao)，它屬(shu)幹(gan)細胞(bao)類型。目前，大(da)多數研究(jiu)用(yong)淋(lin)巴(ba)分(fen)離(li)液分(fen)離(li)提取(qu)骨髓單(dan)核(he)細胞(bao)，最近也(ye)有采用免(mian)疫(yi)磁(ci)珠(zhu)分(fen)離(li)法分(fen)離(li)骨髓單(dan)核(he)細胞(bao)。
方法(fa)簡介：

公司實(shi)驗(yan)室分(fen)離(li)的兔骨髓單(dan)核(he)采用密度(du)梯(ti)度(du)離(li)心法結(jie)合(he)差速(su)貼壁(bi)法制(zhi)備而(er)來，細胞(bao)總(zong)量(liang)約(yue)為5×10?cells/瓶。
質量(liang)檢測(ce)：

公司實(shi)驗(yan)室分(fen)離(li)的兔骨髓單(dan)核(he)經CD68免疫(yi)熒(ying)光鑒(jian)定(ding)，純度可(ke)達(da)90%以上(shang)，且(qie)不(bu)含有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原(yuan)體、細菌、酵母(mu)和真菌等。

壹(yi)、細胞(bao)培(pei)養

1取(qu)材 在(zai)無菌環境(jing)下(xia)從機(ji)體取(qu)出某(mou)種組(zu)織細胞(bao)（視實(shi)驗(yan)目的(de)而(er)定(ding)），經過(guo)壹(yi)定(ding)的(de)處(chu)理(li)（如消化(hua)分(fen)散細胞(bao)、分(fen)離(li)等）後(hou)接(jie)入培(pei)養器(qi)血(xue)中，這(zhe)壹(yi)過程(cheng)稱為(wei)取(qu)材。如(ru)是(shi)細胞(bao)株的(de)擴(kuo)大(da)培(pei)養則(ze)無取(qu)材這(zhe)壹(yi)過程(cheng)。機(ji)體取(qu)出的(de)組(zu)織細胞(bao)的培(pei)養稱為(wei)原(yuan)代培(pei)養。2培(pei)養 將(jiang)取(qu)得的(de)組(zu)織細胞(bao)接入培(pei)養瓶或培(pei)養板(ban)中的過程稱為(wei)培(pei)養。3凍(dong)存及復蘇(su)（可參閱後(hou)面(mian)有關(guan)章(zhang)節(jie)）為(wei)了保(bao)存(cun)細胞(bao)，特(te)別(bie)是(shi)不(bu)易(yi)獲(huo)得的突變型細胞(bao)或細胞(bao)株，要(yao)將(jiang)細胞(bao)凍存(cun)。凍存(cun)的溫(wen)度(du)壹(yi)般用(yong)液氮(dan)的(de)溫(wen)度(du)－196℃，將(jiang)細胞(bao)收集至(zhi)凍(dong)存(cun)管(guan)中加入含保(bao)護(hu)劑（壹(yi)般為(wei)二甲(jia)亞碸或(huo)甘油(you)）的(de)培(pei)養基，以壹(yi)定(ding)的(de)冷(leng)卻(que)速(su)度凍(dong)存，最終(zhong)保(bao)存(cun)於液氮(dan)中。在(zai)極(ji)低的(de)溫(wen)度(du)下，細胞(bao)保(bao)存(cun)的(de)時間(jian)幾乎(hu)是(shi)無限的。復(fu)蘇壹(yi)般采用快融(rong)方法(fa)，即從(cong)液氮(dan)中取(qu)出凍(dong)存管(guan)後，立(li)即放(fang)入37℃水(shui)中，使(shi)之在(zai)壹(yi)分(fen)鐘(zhong)內迅速(su)融(rong)解(jie)。然後(hou)將(jiang)細胞(bao)轉入培(pei)養器(qi)皿(min)中進(jin)行培(pei)養。

二、原代細胞(bao)分(fen)離(li)

凡(fan)是(shi)來源於胚胎(tai)、組(zu)織器(qi)官(guan)及外周血(xue)，經特(te)殊(shu)分(fen)離(li)方法(fa)制(zhi)備而(er)來的(de)原初培(pei)養的(de)細胞(bao)稱之為原(yuan)代細胞(bao)。1懸浮細胞(bao)的分(fen)離(li)方法(fa)組(zu)織材(cai)料(liao)若來自(zi)血(xue)液、羊(yang)水(shui)、胸水(shui)或腹水(shui)的懸液材(cai)料(liao)，的(de)方法(fa)是(shi)采用1000r/min的(de)低(di)速(su)離(li)心10分(fen)鐘(zhong)。經離(li)心後由(you)於各(ge)種細胞(bao)的比重(zhong)不(bu)同可在(zai)分(fen)層液中形(xing)成不(bu)同層，這(zhe)樣(yang)可根(gen)據需要(yao)收獲目的(de)細胞(bao)。2實(shi)體(ti)組(zu)織材(cai)料(liao)的(de)分(fen)離(li)方法(fa)對(dui)於實(shi)體(ti)組(zu)織材(cai)料(liao)，由(you)於細胞(bao)間(jian)結(jie)合(he)緊密，為(wei)了(le)使(shi)組(zu)織中的細胞(bao)充分(fen)分(fen)散，形(xing)成細胞(bao)懸液，可(ke)采用機(ji)械分(fen)散法(fa)（物(wu)理(li)裂解(jie)）和消化(hua)分(fen)離(li)法。

三、細胞(bao)增(zeng)殖(zhi)檢(jian)測(ce)技(ji)術

目前主(zhu)要(yao)有兩種用於檢(jian)測(ce)細胞(bao)增(zeng)殖(zhi)能(neng)力(li)的(de)方法(fa)。壹(yi)種是(shi)直(zhi)接的(de)方法(fa)，通過直(zhi)接測(ce)定(ding)進(jin)行分(fen)裂(lie)

的細胞(bao)數來評價細胞(bao)的增(zeng)殖(zhi)能(neng)力(li)。另(ling)壹(yi)種是(shi)間(jian)接的(de)方法(fa)，即細胞(bao)活(huo)力（cell viability）檢(jian)測方法(fa)，通過檢(jian)測(ce)樣(yang)品中健康(kang)細胞(bao)的數目來(lai)評(ping)價(jia)細胞(bao)的增(zeng)殖(zhi)能(neng)力(li)。顯(xian)然(ran)，細胞(bao)活(huo)力檢(jian)測法(fa)並不(bu)能(neng)最終(zhong)證明(ming)檢(jian)測(ce)樣(yang)品中的細胞(bao)是(shi)否(fou)在(zai)增(zeng)殖(zhi)。如(ru)細胞(bao)在(zai)某(mou)壹(yi)培(pei)養條件下(xia)會(hui)自(zi)發啟(qi)動(dong)雕(diao)亡程序(xu)，但藥(yao)物(wu)的(de)幹擾可(ke)抑制(zhi)雕亡的發生；這(zhe)時(shi)若采用細胞(bao)活(huo)力檢(jian)測法(fa)，顯然可以(yi)區(qu)分(fen)兩(liang)種條件下(xia)的(de)細胞(bao)數量(liang)，但我(wo)們並不(bu)能(neng)從(cong)藥(yao)物(wu)幹(gan)擾組(zu)細胞(bao)數大(da)於對(dui)照組(zu)的事(shi)實(shi)說(shuo)明(ming)藥(yao)物(wu)可(ke)促進(jin)細胞(bao)增(zeng)殖(zhi)的(de)結(jie)論(lun)。所以最直(zhi)接的(de)證據應(ying)該采用方法(fa)壹(yi)。

取(qu)材：首(shou)先(xian)，用培(pei)養液濕(shi)潤(run)所取(qu)的組(zu)織材(cai)料(liao)，並(bing)用(yong)鋒(feng)利的眼(yan)科剪(jian)去除附(fu)在(zai)其(qi)上的(de)脂肪和結(jie)締(di)組(zu)織。接(jie)著用(yong)平衡液（如(ru)PBS或(huo)Hanks液）漂(piao)洗，再(zai)用眼(yan)科彎(wan)剪將(jiang)組(zu)織塊剪成小(xiao)塊。多次用PBS或Hanks液漂(piao)洗，直(zhi)到液體(ti)清亮(liang)、無油(you)滴為止(zhi)。

接種：用濕(shi)潤的(de)吸(xi)管(guan)吸取(qu)切(qie)碎的組(zu)織塊，輕輕(qing)吹(chui)到培(pei)養瓶皿(min)中，並按壹(yi)定(ding)間(jian)距(ju)均勻(yun)放(fang)在(zai)培(pei)養瓶底(di)壁上。註意不(bu)要(yao)過多，確(que)保(bao)組(zu)織塊切(qie)面貼(tie)在(zai)培(pei)養瓶底(di)壁上。

培(pei)養：將(jiang)培(pei)養瓶翻轉(zhuan)，使(shi)瓶底(di)朝上，在(zai)種植(zhi)了組(zu)織塊壹(yi)側的(de)對(dui)側面(mian)加(jia)足(zu)培(pei)養液，避(bi)免(mian)組(zu)織塊與培(pei)養液接(jie)觸(chu)，然後(hou)塞緊瓶塞。將(jiang)種植(zhi)了組(zu)織塊的壹(yi)側朝(chao)上(shang)，靜置(zhi)於37℃培(pei)養箱(xiang)中。待組(zu)織塊貼壁(bi)1到(dao)3小(xiao)時後(hou)翻瓶，使(shi)貼壁(bi)的組(zu)織塊浸沒(mei)在(zai)培(pei)養液中，繼續(xu)靜置(zhi)。換液：每(mei)隔2到3天更(geng)換(huan)壹(yi)次培(pei)養液，或(huo)者(zhe)根(gen)據培(pei)養瓶種顏(yan)色(se)的變化(hua)確(que)定(ding)換(huan)液時(shi)間(jian)。

壹(yi)、原代(dai)細胞(bao)計(ji)數

將(jiang)血(xue)球(qiu)計(ji)數板(ban)及蓋(gai)片(pian)用擦(ca)試(shi)幹(gan)凈(jing)，並將(jiang)蓋(gai)片(pian)蓋(gai)在(zai)計(ji)數板(ban)上。

將(jiang)細胞(bao)懸液吸(xi)出(chu)少許(xu)，滴加在(zai)蓋(gai)片(pian)邊(bian)緣，使(shi)懸液充(chong)滿(man)蓋(gai)片(pian)和計(ji)數板(ban)之間(jian)。

靜置(zhi)3分(fen)鐘(zhong)。

鏡下觀(guan)察(cha)，計(ji)算(suan)計(ji)數板(ban)四大(da)格(ge)細胞(bao)總(zong)數，壓線細胞(bao)只計(ji)左(zuo)側(ce)和上方的(de)。然(ran)後按下式計(ji)算(suan)：

細胞(bao)數/ml＝4大(da)格(ge)細胞(bao)總(zong)數/ 4×10000

註意：鏡下偶見(jian)由兩個以上細胞(bao)組(zu)成的細胞(bao)團，應(ying)按單(dan)個(ge)細胞(bao)計(ji)算(suan)，若細胞(bao)團占(zhan)10%以(yi)上，說(shuo)明(ming)分(fen)散不(bu)好(hao)，需重(zhong)新(xin)制(zhi)備細胞(bao)懸液。

二、原代細胞(bao)活(huo)力

將(jiang)細胞(bao)懸液以(yi)0.5ml加(jia)入試(shi)管(guan)中。

加入0.5ml 0.4%臺(tai)盼(pan)蘭染(ran)液，染(ran)色(se)2壹(yi)3分(fen)鐘(zhong)。

吸取(qu)少許(xu)懸液塗於載(zai)玻(bo)片(pian)上，加(jia)上(shang)蓋(gai)片(pian)。

鏡下取(qu)幾個(ge)任意視野(ye)分(fen)別(bie)計(ji)死細胞(bao)和活(huo)細胞(bao)數，計(ji)細胞(bao)活(huo)力。

死細胞(bao)能(neng)被(bei)臺(tai)盼(pan)蘭染(ran)上色(se)，鏡下可(ke)見(jian)深(shen)蘭(lan)色(se)的細胞(bao)，活(huo)細胞(bao)不(bu)被染色(se)，鏡下呈(cheng)無色(se)透明(ming)狀(zhuang)。

活(huo)力測(ce)定(ding)可(ke)以(yi)和細胞(bao)計(ji)數合(he)起來進(jin)行，但要(yao)考(kao)慮(lv)到染(ran)液對(dui)原細胞(bao)懸液的(de)加(jia)倍稀釋(shi)作(zuo)用(yong)。