【概要描(miao)述(shu)】兔肺(fei)動脈成纖維(wei)細(xi)胞的相關(guan)產品(pin)：HPAEC人(ren)肺(fei)動脈內(nei)皮(pi)細(xi)胞小(xiao)鼠原代(dai)輸卵(luan)管(guan)平(ping)滑肌(ji)細(xi)胞兔原代(dai)頸(jing)動脈內(nei)皮(pi)細(xi)胞小(xiao)鼠原代(dai)食(shi)管(guan)上(shang)皮(pi)細(xi)胞豬(zhu)原代(dai)乳(ru)腺上(shang)皮(pi)細(xi)胞兔原代(dai)頜骨骨(gu)髓(sui)間充(chong)質幹(gan)細(xi)胞小(xiao)鼠淋(lin)巴(ba)內(nei)皮(pi)細(xi)胞人(ren)原代(dai)鞏(gong)膜(mo)成纖維(wei)細(xi)胞豬(zhu)原代(dai)睪(gao)丸(wan)支持(chi)細(xi)胞人(ren)原代(dai)真皮成纖維(wei)細(xi)胞

兔肺(fei)動脈成纖維(wei)細(xi)胞

培養(yang)基 含FBS、生長添(tian)加(jia)劑、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液頻(pin)率(lv) 每2-3天換液壹(yi)次(ci)

生長特性(xing) 貼(tie)壁

細(xi)胞形(xing)態(tai) 成纖維(wei)細(xi)胞樣(yang)

傳代(dai)特(te)性(xing) 可(ke)傳5代(dai)左(zuo)右(you)；3代(dai)以(yi)內(nei)狀(zhuang)態(tai)

消化液 0.25%yi蛋(dan)白(bai)酶(mei)

培養(yang)條件 氣相：空氣(qi)，95%；CO2，5%

兔肺(fei)動脈成纖維(wei)分離自(zi)肺動脈組(zu)織(zhi)；肺(fei)動脈亦稱肺(fei)動脈幹(gan)。在呼吸(xi)空(kong)氣的脊(ji)椎動物(wu)中(zhong)，把(ba)靜脈血(xue)由心(xin)臟(zang)導向(xiang)肺臟(zang)的動脈。肺(fei)大(da)動脈起於右(you)心(xin)室(shi)，在主動脈之(zhi)前向(xiang)左上(shang)後方斜行，在主動脈弓(gong)下(xia)方分為左、右(you)肺動脈，經(jing)肺(fei)門(men)入(ru)肺。肺(fei)動脈幹(gan)位(wei)於心(xin)包(bao)內，為壹粗(cu)短(duan)的動脈幹(gan)。起自(zi)右(you)心(xin)室(shi)，在升主動脈前方向(xiang)左後上(shang)方斜行，至主動脈弓(gong)下(xia)方分為左、右(you)肺動脈。左(zuo)肺(fei)動脈較短(duan)，在左主支氣管(guan)前方橫行，分二(er)支進(jin)入(ru)左(zuo)肺(fei)上(shang)、下(xia)葉(ye)。右(you)肺動脈較長(chang)而(er)粗(cu)，經(jing)升主動脈和(he)上(shang)腔靜脈後方向(xiang)右(you)橫行，至右(you)肺門(men)處分為三支進(jin)入(ru)右(you)肺上(shang)、中(zhong)、下(xia)葉(ye)。成纖維(wei)細(xi)胞（Fibroblast）是疏松結締(di)組(zu)織的主要(yao)細(xi)胞成分(fen)，由胚胎(tai)時(shi)期的間充(chong)質細(xi)胞分(fen)化而(er)來；成纖維(wei)細(xi)胞較大(da)，輪廓(kuo)清(qing)楚(chu)，多(duo)為突起的紡(fang)錘(chui)形(xing)或(huo)星形(xing)的扁(bian)平(ping)狀(zhuang)結構(gou)，其(qi)細(xi)胞核(he)呈規則的卵(luan)圓(yuan)形(xing)，核(he)仁(ren)大(da)而(er)明(ming)顯(xian)。成纖維(wei)細(xi)胞功(gong)能活動旺盛，細(xi)胞質(zhi)嗜(shi)弱堿(jian)性(xing)，具(ju)明(ming)顯(xian)的蛋(dan)白(bai)質(zhi)合成和(he)分(fen)泌活動，在壹定條件下(xia)，它(ta)可(ke)以實現(xian)跟纖維(wei)細(xi)胞的互(hu)相轉化；成纖維(wei)細(xi)胞對(dui)不同(tong)程(cheng)度(du)的細(xi)胞變(bian)性(xing)、壞(huai)死(si)和(he)組(zu)織(zhi)缺損的修(xiu)復(fu)有著(zhe)十分重要的作(zuo)用(yong)。剛分(fen)離的肺(fei)動脈成纖維(wei)細(xi)胞呈(cheng)圓(yuan)形(xing)、折(zhe)光(guang)性(xing)良(liang)好，懸浮於培(pei)養(yang)基中(zhong)。30min細(xi)胞貼(tie)壁，其中(zhong)部分(fen)開(kai)始伸出(chu)偽(wei)足，表現為小的突(tu)起；6h後細(xi)胞基本(ben)貼(tie)壁wan全，伸展(zhan)成梭(suo)形(xing)，胞核(he)清晰，分(fen)布較均(jun)勻(yun)，散在生長，不聚集(ji)成團(tuan)；細(xi)胞生(sheng)長迅(xun)速，5-7天(tian)即(ji)呈(cheng)融合狀(zhuang)態(tai)，細(xi)胞排列緊(jin)密(mi)，有(you)的交(jiao)叉(cha)重疊生長(chang)，平(ping)坦、胞體(ti)較大(da)，細(xi)胞質(zhi)透(tou)明(ming)，細(xi)胞核(he)較大(da)，呈(cheng)橢(tuo)圓(yuan)形(xing)，顏(yan)色淡(dan)。細(xi)胞融(rong)合，並(bing)彼此(ci)連接成網狀(zhuang)；細(xi)胞呈(cheng)突起的紡(fang)錘(chui)形(xing)或(huo)星形(xing)的扁(bian)平(ping)分布。肺動脈成纖維(wei)細(xi)胞在生理條件下(xia)的主要(yao)功能包(bao)括(kuo)：構造和維(wei)持(chi)肺(fei)動脈的正常形(xing)態(tai)；合成和(he)釋(shi)放(fang)細(xi)胞外(wai)基質(zhi)；組(zu)織損(sun)傷後及(ji)時(shi)大(da)量(liang)聚集(ji)修(xiu)復(fu)損傷組織。
方法簡(jian)介(jie)：

公司實驗(yan)室(shi)分離的兔肺(fei)動脈成纖維(wei)采用(yong)yi蛋(dan)白(bai)酶(mei)-膠原酶(mei)混(hun)合消(xiao)化(hua)法結合差(cha)速貼(tie)壁法制備而來，細(xi)胞總(zong)量(liang)約為5×10?cells/瓶。
質量(liang)檢(jian)測(ce)：

公司實驗(yan)室(shi)分離的兔肺(fei)動脈成纖維(wei)經Vimentin免(mian)疫熒(ying)光(guang)鑒(jian)定，純度(du)可(ke)達90%以(yi)上(shang)，且(qie)不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體(ti)、細(xi)菌(jun)、酵(jiao)母(mu)和真菌(jun)等(deng)。

壹、細(xi)胞培(pei)養(yang)

1取材 在無(wu)菌(jun)環(huan)境(jing)下(xia)從(cong)機體取出某(mou)種(zhong)組織細(xi)胞（視實驗(yan)目(mu)的而(er)定），經(jing)過(guo)壹(yi)定的處理（如消化分散(san)細(xi)胞、分(fen)離等(deng)）後接入培養(yang)器(qi)血中(zhong)，這壹過程稱為取材(cai)。如是細(xi)胞株的擴大(da)培(pei)養(yang)則無(wu)取材這壹過程。機體(ti)取出的組(zu)織(zhi)細(xi)胞的培(pei)養(yang)稱為原代(dai)培(pei)養(yang)。2培養(yang) 將取得的組(zu)織(zhi)細(xi)胞接入培養(yang)瓶或(huo)培養(yang)板(ban)中(zhong)的過(guo)程(cheng)稱(cheng)為培養(yang)。3凍存及(ji)復(fu)蘇（可(ke)參閱(yue)後面(mian)有(you)關(guan)章(zhang)節(jie)）為了保(bao)存細(xi)胞，特(te)別是(shi)不易(yi)獲得的突(tu)變(bian)型(xing)細(xi)胞或(huo)細(xi)胞株，要(yao)將細(xi)胞凍(dong)存。凍(dong)存的溫(wen)度(du)壹(yi)般用(yong)液氮的溫(wen)度(du)－196℃，將細(xi)胞收(shou)集至(zhi)凍(dong)存管(guan)中(zhong)加(jia)入含保(bao)護劑(ji)（壹(yi)般為二(er)甲(jia)亞(ya)碸(feng)或(huo)甘(gan)油）的培(pei)養(yang)基，以(yi)壹(yi)定的冷卻速度凍(dong)存，最(zui)終保(bao)存於液氮中(zhong)。在極低(di)的溫(wen)度(du)下(xia)，細(xi)胞保(bao)存的時(shi)間幾(ji)乎是(shi)無(wu)限的。復(fu)蘇壹(yi)般采(cai)用(yong)快(kuai)融(rong)方法，即從液氮中(zhong)取(qu)出(chu)凍(dong)存管(guan)後，立(li)即放(fang)入(ru)37℃水中(zhong)，使(shi)之(zhi)在壹分鐘內(nei)迅速(su)融(rong)解(jie)。然後將細(xi)胞轉入培養(yang)器(qi)皿中(zhong)進(jin)行培養(yang)。

二(er)、原代(dai)細(xi)胞分(fen)離

凡是來源於胚(pei)胎、組(zu)織器(qi)官及(ji)外(wai)周(zhou)血(xue)，經特殊分離方法制備而來的原初(chu)培(pei)養(yang)的細(xi)胞稱(cheng)之為原代(dai)細(xi)胞。1懸浮細(xi)胞的分(fen)離方法組織材(cai)料(liao)若(ruo)來自(zi)血液、羊水、胸(xiong)水或(huo)腹水的懸液材(cai)料(liao)，的方法是采用(yong)1000r/min的低(di)速離心(xin)10分(fen)鐘。經(jing)離心(xin)後由於各(ge)種(zhong)細(xi)胞的比重不同(tong)可(ke)在分層液中(zhong)形(xing)成不同(tong)層(ceng)，這樣(yang)可(ke)根據需(xu)要收(shou)獲目(mu)的細(xi)胞。2實體(ti)組(zu)織材(cai)料(liao)的分(fen)離方法對(dui)於實體(ti)組(zu)織材(cai)料(liao)，由於細(xi)胞間結合緊(jin)密(mi)，為了使組(zu)織(zhi)中(zhong)的細(xi)胞充(chong)分分(fen)散，形(xing)成細(xi)胞懸液，可(ke)采用(yong)機械分散(san)法（物(wu)理裂(lie)解(jie)）和(he)消化分(fen)離法。

三、細(xi)胞增(zeng)殖檢(jian)測技(ji)術(shu)

目前主要(yao)有兩種(zhong)用(yong)於檢(jian)測細(xi)胞增(zeng)殖能(neng)力(li)的方法。壹種是(shi)直(zhi)接的方法，通過直(zhi)接測定進(jin)行分裂(lie)

的細(xi)胞數來評(ping)價細(xi)胞的增(zeng)殖(zhi)能(neng)力(li)。另壹(yi)種是(shi)間接的方法，即細(xi)胞活力(li)（cell viability）檢測(ce)方法，通過檢(jian)測(ce)樣(yang)品(pin)中(zhong)健康細(xi)胞的數目(mu)來評(ping)價細(xi)胞的增(zeng)殖(zhi)能(neng)力(li)。顯(xian)然，細(xi)胞活力(li)檢測(ce)法並(bing)不能(neng)最(zui)終證明(ming)檢測(ce)樣(yang)品(pin)中(zhong)的細(xi)胞是(shi)否在增殖。如細(xi)胞在某壹培養(yang)條件下(xia)會自(zi)發啟(qi)動雕亡程序，但(dan)藥(yao)物(wu)的幹(gan)擾可(ke)抑(yi)制雕亡的發生(sheng)；這時(shi)若(ruo)采用(yong)細(xi)胞活力(li)檢測(ce)法，顯(xian)然可(ke)以區(qu)分(fen)兩種條件下(xia)的細(xi)胞數量(liang)，但(dan)我(wo)們(men)並(bing)不能(neng)從(cong)藥(yao)物(wu)幹擾組(zu)細(xi)胞數大(da)於對(dui)照組的事(shi)實說(shuo)明(ming)藥物(wu)可(ke)促(cu)進(jin)細(xi)胞增(zeng)殖的結論。所(suo)以最(zui)直(zhi)接的證據(ju)應該(gai)采(cai)用(yong)方法壹。

取材：首先，用(yong)培養(yang)液濕(shi)潤所(suo)取的組(zu)織(zhi)材(cai)料(liao)，並(bing)用(yong)鋒(feng)利(li)的眼科(ke)剪去(qu)除(chu)附在其上(shang)的脂肪(fang)和結締(di)組(zu)織。接著(zhe)用(yong)平(ping)衡液（如PBS或(huo)Hanks液）漂洗，再用(yong)眼科(ke)彎(wan)剪將組織塊剪成小(xiao)塊(kuai)。多(duo)次(ci)用(yong)PBS或(huo)Hanks液漂洗，直(zhi)到(dao)液體(ti)清(qing)亮、無(wu)油滴(di)為止。

接種：用(yong)濕潤的吸(xi)管(guan)吸(xi)取(qu)切碎的組(zu)織(zhi)塊(kuai)，輕(qing)輕(qing)吹(chui)到(dao)培(pei)養(yang)瓶皿(min)中(zhong)，並(bing)按壹定間距(ju)均(jun)勻(yun)放(fang)在培養(yang)瓶底(di)壁上(shang)。註(zhu)意不要(yao)過(guo)多(duo)，確保(bao)組(zu)織(zhi)塊(kuai)切面(mian)貼(tie)在培養(yang)瓶底(di)壁上(shang)。

培養(yang)：將培養(yang)瓶翻(fan)轉，使瓶底朝(chao)上(shang)，在種植(zhi)了組織(zhi)塊(kuai)壹側(ce)的對(dui)側(ce)面(mian)加(jia)足培(pei)養(yang)液，避(bi)免(mian)組織(zhi)塊(kuai)與(yu)培(pei)養(yang)液接觸，然後塞(sai)緊(jin)瓶塞(sai)。將種植(zhi)了組織(zhi)塊(kuai)的壹(yi)側(ce)朝(chao)上(shang)，靜置(zhi)於37℃培(pei)養(yang)箱中(zhong)。待(dai)組(zu)織(zhi)塊貼(tie)壁1到3小時(shi)後翻(fan)瓶，使(shi)貼(tie)壁的組(zu)織(zhi)塊(kuai)浸沒在培養(yang)液中(zhong)，繼(ji)續(xu)靜置(zhi)。換(huan)液：每(mei)隔(ge)2到3天(tian)更(geng)換壹(yi)次(ci)培(pei)養(yang)液，或(huo)者根據培(pei)養(yang)瓶種(zhong)顏(yan)色的變(bian)化(hua)確(que)定換(huan)液時(shi)間。

壹、原代(dai)細(xi)胞計(ji)數

將血球(qiu)計(ji)數板(ban)及蓋(gai)片(pian)用(yong)擦試幹(gan)凈，並(bing)將蓋片(pian)蓋在計(ji)數板(ban)上(shang)。

將細(xi)胞懸液吸(xi)出(chu)少許(xu)，滴(di)加(jia)在蓋片(pian)邊(bian)緣(yuan)，使懸液充(chong)滿蓋片(pian)和計(ji)數板(ban)之間。

靜置(zhi)3分(fen)鐘。

鏡下觀(guan)察(cha)，計(ji)算(suan)計(ji)數板(ban)四大(da)格細(xi)胞總(zong)數，壓(ya)線(xian)細(xi)胞只計(ji)左側(ce)和上(shang)方的。然後按下式(shi)計(ji)算(suan)：

細(xi)胞數/ml＝4大(da)格細(xi)胞總(zong)數/ 4×10000

註意：鏡下偶見(jian)由兩個(ge)以(yi)上(shang)細(xi)胞組(zu)成的細(xi)胞團(tuan)，應按單個(ge)細(xi)胞計(ji)算(suan)，若(ruo)細(xi)胞團(tuan)占(zhan)10%以上(shang)，說(shuo)明(ming)分散(san)不好(hao)，需(xu)重新制備細(xi)胞懸液。

二(er)、原代(dai)細(xi)胞活力(li)

將細(xi)胞懸液以(yi)0.5ml加(jia)入試管(guan)中(zhong)。

加(jia)入0.5ml 0.4%臺盼(pan)蘭(lan)染(ran)液，染(ran)色2壹3分鐘。

吸(xi)取(qu)少許(xu)懸液塗(tu)於載(zai)玻片(pian)上(shang)，加(jia)上(shang)蓋(gai)片(pian)。

鏡下取幾(ji)個任(ren)意視野分別計(ji)死細(xi)胞和(he)活細(xi)胞數，計(ji)細(xi)胞活力(li)。

死細(xi)胞能(neng)被臺盼(pan)蘭(lan)染(ran)上(shang)色，鏡下可(ke)見深(shen)蘭(lan)色的細(xi)胞，活細(xi)胞不被(bei)染(ran)色，鏡下呈無(wu)色透(tou)明(ming)狀(zhuang)。

活力(li)測定可(ke)以和(he)細(xi)胞計(ji)數合起來進(jin)行，但要(yao)考慮到染(ran)液對(dui)原細(xi)胞懸液的加(jia)倍稀(xi)釋作(zuo)用(yong)。