【概(gai)要(yao)描(miao)述(shu)】兔肺泡巨噬(shi)細(xi)胞(bao)的相關產品：LTEP-s人肺鱗(lin)癌細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)原(yuan)代(dai)視(shi)網(wang)膜微(wei)血管(guan)內皮細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代(dai)腸(chang)粘膜上皮細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代(dai)輸(shu)尿(niao)管(guan)平滑(hua)肌(ji)細(xi)胞(bao)豬(zhu)原(yuan)代(dai)睪(gao)丸間質細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代(dai)小(xiao)梁網(wang)細(xi)胞(bao)狗(gou)原(yuan)代(dai)II型(xing)肺泡上皮細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)原(yuan)代(dai)肝(gan)實(shi)質(zhi)細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代(dai)視(shi)網(wang)膜色(se)上皮細(xi)胞(bao)大(da)鼠(shu)原(yuan)代(dai)小(xiao)腸(chang)成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)

兔肺泡巨噬(shi)細(xi)胞(bao)

培養(yang)基(ji) 含FBS、生長(chang)添(tian)加劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液(ye)頻(pin)率 每(mei)2-3天(tian)換液(ye)壹(yi)次

生長(chang)特性(xing) 貼壁(bi)

細(xi)胞(bao)形(xing)態(tai) 巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao)樣(yang)

傳(chuan)代(dai)特(te)性(xing) 屬(shu)於(yu)終(zhong)末分(fen)化細(xi)胞(bao)；屬(shu)於(yu)不增(zeng)殖細(xi)胞(bao)群(qun)

消化液 利多ka因（12mM）

培(pei)養條件(jian) 氣相：空(kong)氣，95%；CO2，5%

兔肺泡巨噬(shi)分(fen)離(li)自(zi)肺組織；肺是(shi)機(ji)體(ti)的呼吸(xi)器官，位於(yu)胸(xiong)腔(qiang)，左(zuo)右(you)各(ge)壹，覆蓋(gai)於(yu)心(xin)之(zhi)上。肺有分(fen)葉，左二右(you)三，共五葉。肺經(jing)肺系(xi)(指(zhi)氣(qi)管(guan)、支氣(qi)管(guan)等)與(yu)喉、鼻(bi)相連(lian)，故稱(cheng)喉為(wei)肺之(zhi)門戶，鼻(bi)為(wei)肺之(zhi)外(wai)竅。肺泡由單層上皮細(xi)胞(bao)構(gou)成(cheng)的半球(qiu)狀囊(nang)泡。肺中的支氣(qi)管(guan)經(jing)多(duo)次(ci)反復(fu)分(fen)枝成(cheng)無(wu)數(shu)細(xi)支氣(qi)管(guan)，它們(men)的末端膨(peng)大成(cheng)囊(nang)，囊(nang)的四(si)周(zhou)有很(hen)多(duo)突(tu)出(chu)的小(xiao)囊(nang)泡，即為(wei)肺泡。巨噬(shi)細(xi)胞(bao)屬(shu)免(mian)疫細(xi)胞(bao)，有(you)多(duo)種功能(neng)，是(shi)研(yan)究細(xi)胞(bao)吞噬(shi)、細(xi)胞(bao)免(mian)疫和分(fen)子免(mian)疫學(xue)的重要(yao)對象(xiang)。巨噬(shi)細(xi)胞(bao)較(jiao)易獲(huo)得(de)，便(bian)於(yu)培(pei)養(yang)，並(bing)可進(jin)行(xing)純化(hua)。巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao)屬(shu)不繁(fan)殖細(xi)胞(bao)群(qun)，在(zai)條件(jian)適(shi)宜(yi)下可生活(huo)2-3周(zhou)，多用(yong)做原(yuan)代(dai)培(pei)養(yang)，難以長(chang)期生(sheng)存(cun)。巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao)(Macrophages)是(shi)壹種(zhong)位(wei)於(yu)組(zu)織(zhi)內的白血(xue)球，源自單核細(xi)胞(bao)，而(er)單核細(xi)胞(bao)又(you)來源(yuan)於(yu)骨髓(sui)中的前體細(xi)胞(bao)。巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao)和單核細(xi)胞(bao)皆(jie)為(wei)吞噬(shi)細(xi)胞(bao)，在(zai)脊椎(zhui)動(dong)物體內參與非特(te)異(yi)性(xing)防(fang)衛(先天(tian)性(xing)免(mian)疫)和特(te)異性防(fang)衛(細(xi)胞(bao)免(mian)疫)。它(ta)們(men)的主要(yao)功能(neng)是(shi)以固(gu)定細(xi)胞(bao)或遊離(li)細(xi)胞(bao)的形式對細(xi)胞(bao)殘片(pian)及(ji)病原(yuan)體(ti)進(jin)行(xing)噬(shi)菌(jun)作用(即吞噬(shi)以及(ji)消化(hua))，並(bing)激活(huo)淋(lin)巴球(qiu)或其(qi)他免(mian)疫細(xi)胞(bao)，令其(qi)對病原(yuan)體(ti)作出反應(ying)。肺泡巨噬(shi)細(xi)胞(bao)的吞噬(shi)、免(mian)疫和分(fen)泌作用都十分(fen)活躍，有重要(yao)防(fang)禦(yu)功能(neng)。肺泡是(shi)重要(yao)的巨噬(shi)細(xi)胞(bao)儲(chu)存(cun)器(qi)官，為(wei)結(jie)核病(bing)的研(yan)究提(ti)供了(le)重要(yao)的材料(liao)。
方法簡(jian)介：

公(gong)司實(shi)驗(yan)室(shi)分(fen)離(li)的兔肺泡巨噬(shi)采(cai)用機(ji)械研(yan)磨(mo)結(jie)合(he)差速(su)貼壁(bi)法制備而來，細(xi)胞(bao)總(zong)量(liang)約為(wei)5×10?cells/瓶(ping)。
質(zhi)量檢(jian)測：

公(gong)司實(shi)驗(yan)室(shi)分(fen)離(li)的兔肺泡巨噬(shi)經(jing)CD68免疫熒光鑒定(ding)，純度(du)可達90%以上，且(qie)不含有HIV-1、HBV、HCV、支原(yuan)體(ti)、細(xi)菌(jun)、酵母(mu)和真(zhen)菌(jun)等(deng)。

壹、細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)

1取(qu)材 在(zai)無菌(jun)環境下(xia)從機(ji)體(ti)取(qu)出某(mou)種(zhong)組織細(xi)胞(bao)（視(shi)實(shi)驗(yan)目(mu)的而定(ding)），經(jing)過(guo)壹定(ding)的處(chu)理（如(ru)消化分(fen)散(san)細(xi)胞(bao)、分(fen)離(li)等(deng)）後接(jie)入(ru)培養(yang)器血(xue)中，這壹(yi)過(guo)程稱(cheng)為(wei)取(qu)材。如(ru)是(shi)細(xi)胞(bao)株(zhu)的擴(kuo)大培養(yang)則(ze)無取(qu)材這壹(yi)過(guo)程。機(ji)體(ti)取(qu)出的組織(zhi)細(xi)胞(bao)的培養(yang)稱(cheng)為(wei)原(yuan)代(dai)培(pei)養(yang)。2培養 將取(qu)得的組織(zhi)細(xi)胞(bao)接(jie)入(ru)培養(yang)瓶或培養(yang)板(ban)中的過(guo)程稱(cheng)為(wei)培養(yang)。3凍(dong)存(cun)及(ji)復(fu)蘇(su)（可參閱(yue)後面有關章節）為(wei)了(le)保(bao)存(cun)細(xi)胞(bao)，特(te)別(bie)是(shi)不易獲得的突變型細(xi)胞(bao)或細(xi)胞(bao)株(zhu)，要(yao)將細(xi)胞(bao)凍(dong)存(cun)。凍(dong)存(cun)的溫度(du)壹(yi)般(ban)用(yong)液(ye)氮(dan)的溫度(du)－196℃，將細(xi)胞(bao)收(shou)集至凍存(cun)管(guan)中加入(ru)含保(bao)護劑（壹(yi)般(ban)為(wei)二甲(jia)亞(ya)碸或甘(gan)油）的培養(yang)基(ji)，以壹定(ding)的冷卻速(su)度(du)凍(dong)存(cun)，最(zui)終保(bao)存(cun)於(yu)液(ye)氮(dan)中。在極(ji)低的溫度(du)下(xia)，細(xi)胞(bao)保(bao)存(cun)的時間幾(ji)乎是(shi)無限(xian)的。復(fu)蘇(su)壹般(ban)采(cai)用快融方(fang)法，即從液氮(dan)中取(qu)出凍(dong)存(cun)管(guan)後，立(li)即放入(ru)37℃水中，使(shi)之(zhi)在壹(yi)分(fen)鐘(zhong)內迅速(su)融解。然(ran)後將細(xi)胞(bao)轉(zhuan)入(ru)培養(yang)器皿中進(jin)行(xing)培(pei)養(yang)。

二、原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)分(fen)離(li)

凡是(shi)來源(yuan)於(yu)胚(pei)胎(tai)、組(zu)織(zhi)器(qi)官及(ji)外(wai)周(zhou)血(xue)，經(jing)特(te)殊(shu)分(fen)離(li)方(fang)法制備而來的原(yuan)初(chu)培(pei)養(yang)的細(xi)胞(bao)稱(cheng)之(zhi)為(wei)原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)。1懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞(bao)的分(fen)離(li)方(fang)法組(zu)織材(cai)料(liao)若(ruo)來自(zi)血(xue)液(ye)、羊水(shui)、胸水或腹水(shui)的懸液(ye)材料(liao)，的方法是(shi)采(cai)用1000r/min的低速(su)離(li)心(xin)10分(fen)鐘(zhong)。經(jing)離(li)心(xin)後由(you)於(yu)各(ge)種細(xi)胞(bao)的比重不同(tong)可在分(fen)層液中形成(cheng)不同(tong)層，這樣(yang)可根據需要(yao)收(shou)獲(huo)目(mu)的細(xi)胞(bao)。2實(shi)體(ti)組(zu)織材料(liao)的分(fen)離(li)方(fang)法對於(yu)實(shi)體(ti)組(zu)織材料(liao)，由於(yu)細(xi)胞(bao)間結(jie)合(he)緊密，為(wei)了(le)使(shi)組(zu)織中的細(xi)胞(bao)充(chong)分(fen)分(fen)散(san)，形(xing)成(cheng)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)，可采(cai)用機(ji)械分(fen)散(san)法（物理裂(lie)解）和消(xiao)化分(fen)離(li)法。

三(san)、細(xi)胞(bao)增(zeng)殖檢(jian)測技(ji)術

目(mu)前主要(yao)有(you)兩(liang)種用於(yu)檢(jian)測細(xi)胞(bao)增(zeng)殖能(neng)力的方法。壹(yi)種是(shi)直(zhi)接的方法，通(tong)過(guo)直(zhi)接測(ce)定進(jin)行(xing)分(fen)裂

的細(xi)胞(bao)數(shu)來評價(jia)細(xi)胞(bao)的增(zeng)殖能(neng)力。另(ling)壹種(zhong)是(shi)間接的方法，即細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)（cell viability）檢(jian)測方法，通(tong)過(guo)檢(jian)測樣(yang)品(pin)中健康(kang)細(xi)胞(bao)的數(shu)目(mu)來評價(jia)細(xi)胞(bao)的增(zeng)殖能(neng)力。顯(xian)然(ran)，細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢(jian)測法並(bing)不能(neng)最終(zhong)證(zheng)明(ming)檢(jian)測樣(yang)品(pin)中的細(xi)胞(bao)是(shi)否在(zai)增(zeng)殖。如(ru)細(xi)胞(bao)在(zai)某(mou)壹(yi)培養條件(jian)下(xia)會自(zi)發(fa)啟動(dong)雕(diao)亡(wang)程(cheng)序，但(dan)藥物的幹(gan)擾可抑制雕亡的發(fa)生；這時若(ruo)采(cai)用細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢(jian)測法，顯(xian)然(ran)可以區(qu)分(fen)兩(liang)種條件(jian)下(xia)的細(xi)胞(bao)數(shu)量(liang)，但(dan)我(wo)們並(bing)不能(neng)從藥(yao)物幹(gan)擾組(zu)細(xi)胞(bao)數(shu)大(da)於(yu)對照(zhao)組(zu)的事(shi)實(shi)說(shuo)明(ming)藥物可促進(jin)細(xi)胞(bao)增(zeng)殖的結(jie)論。所以最直(zhi)接的證據(ju)應(ying)該采(cai)用方法壹(yi)。

取(qu)材：首先，用(yong)培養液濕潤所取(qu)的組織(zhi)材料(liao)，並(bing)用(yong)鋒(feng)利的眼科剪去除附(fu)在其(qi)上的脂肪和結(jie)締組(zu)織(zhi)。接(jie)著(zhe)用(yong)平衡液（如(ru)PBS或Hanks液）漂(piao)洗，再(zai)用眼科彎剪將組織(zhi)塊(kuai)剪成(cheng)小(xiao)塊(kuai)。多次(ci)用PBS或Hanks液漂(piao)洗，直(zhi)到液(ye)體清(qing)亮(liang)、無(wu)油(you)滴(di)為(wei)止。

接種(zhong)：用(yong)濕(shi)潤的吸管(guan)吸取(qu)切碎(sui)的組織(zhi)塊(kuai)，輕(qing)輕(qing)吹(chui)到(dao)培(pei)養(yang)瓶(ping)皿中，並(bing)按(an)壹定(ding)間距(ju)均勻放在(zai)培(pei)養瓶(ping)底壁(bi)上。註意(yi)不要(yao)過(guo)多，確保(bao)組(zu)織(zhi)塊(kuai)切面貼在(zai)培(pei)養瓶底(di)壁(bi)上。

培養(yang)：將培養(yang)瓶翻轉，使(shi)瓶(ping)底朝上，在(zai)種(zhong)植了(le)組織塊(kuai)壹側的對側面加足培養液，避(bi)免組織(zhi)塊(kuai)與培(pei)養液接觸，然(ran)後塞(sai)緊瓶塞(sai)。將種植(zhi)了(le)組織塊(kuai)的壹側朝上，靜(jing)置(zhi)於(yu)37℃培(pei)養(yang)箱(xiang)中。待組(zu)織(zhi)塊(kuai)貼壁(bi)1到3小(xiao)時後翻(fan)瓶，使(shi)貼(tie)壁(bi)的組織(zhi)塊(kuai)浸沒(mei)在培養液中，繼(ji)續靜(jing)置(zhi)。換液(ye)：每(mei)隔(ge)2到(dao)3天(tian)更(geng)換壹(yi)次(ci)培養(yang)液，或者根據培(pei)養瓶(ping)種(zhong)顏色的變化確定(ding)換液(ye)時間。

壹、原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)

將血球(qiu)計數(shu)板(ban)及(ji)蓋(gai)片(pian)用擦試(shi)幹(gan)凈(jing)，並(bing)將蓋(gai)片(pian)蓋(gai)在(zai)計數(shu)板(ban)上。

將細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)吸出少(shao)許，滴(di)加(jia)在(zai)蓋(gai)片(pian)邊(bian)緣，使(shi)懸(xuan)液充(chong)滿蓋(gai)片(pian)和計(ji)數(shu)板(ban)之(zhi)間。

靜(jing)置(zhi)3分(fen)鐘(zhong)。

鏡下觀(guan)察，計(ji)算(suan)計數(shu)板(ban)四(si)大(da)格細(xi)胞(bao)總(zong)數(shu)，壓線細(xi)胞(bao)只(zhi)計左(zuo)側和上方(fang)的。然(ran)後按(an)下式計算(suan)：

細(xi)胞(bao)數(shu)/ml＝4大(da)格細(xi)胞(bao)總(zong)數(shu)/ 4×10000

註意(yi)：鏡下偶(ou)見(jian)由兩(liang)個以上細(xi)胞(bao)組(zu)成(cheng)的細(xi)胞(bao)團(tuan)，應(ying)按(an)單個細(xi)胞(bao)計(ji)算(suan)，若(ruo)細(xi)胞(bao)團(tuan)占10%以上，說(shuo)明(ming)分(fen)散(san)不好，需重新制備細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)。

二(er)、原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)

將細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)以0.5ml加入(ru)試管(guan)中。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺(tai)盼蘭(lan)染液，染色2壹3分(fen)鐘(zhong)。

吸取(qu)少許懸液(ye)塗(tu)於(yu)載(zai)玻片上，加(jia)上蓋(gai)片(pian)。

鏡下取(qu)幾(ji)個任意視(shi)野分(fen)別計死(si)細(xi)胞(bao)和活(huo)細(xi)胞(bao)數(shu)，計(ji)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)。

死(si)細(xi)胞(bao)能(neng)被臺(tai)盼蘭(lan)染上色(se)，鏡下可見(jian)深蘭(lan)色(se)的細(xi)胞(bao)，活(huo)細(xi)胞(bao)不被染色，鏡下呈(cheng)無(wu)色透明狀。

活(huo)力測(ce)定(ding)可以和細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)合(he)起來進(jin)行(xing)，但(dan)要(yao)考(kao)慮到(dao)染液對原(yuan)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)的加倍(bei)稀釋作用。