【概(gai)要描(miao)述】兔腹腔(qiang)巨(ju)噬細(xi)胞(bao)的(de)相(xiang)關(guan)產品(pin)：NCI-H1703-Luc人肺鱗癌細胞人原代(dai)心(xin)臟(zang)微(wei)血管平滑(hua)肌細胞大(da)鼠原代結(jie)腸隱窩上(shang)皮(pi)細(xi)胞兔原(yuan)代中耳(er)上(shang)皮(pi)細(xi)胞兔原(yuan)代視(shi)網膜(mo)神(shen)經(jing)節細(xi)胞兔原(yuan)代腦微(wei)血管內(nei)皮(pi)細(xi)胞大(da)鼠原代子宮內(nei)膜(mo)上皮(pi)細(xi)胞大(da)鼠原代肝(gan)kupffer細胞(bao)小鼠原代陰道真(zhen)皮(pi)成(cheng)纖維(wei)細(xi)胞大(da)鼠原代破骨(gu)細胞(bao)

兔腹腔(qiang)巨(ju)噬細(xi)胞(bao)

培(pei)養(yang)基 含FBS、生(sheng)長(chang)添(tian)加劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等

換(huan)液(ye)頻率 每(mei)2-3天(tian)換(huan)液(ye)壹次

生(sheng)長(chang)特性(xing) 貼(tie)壁(bi)

細(xi)胞(bao)形態 巨(ju)噬細(xi)胞(bao)樣(yang)

傳代特(te)性 屬(shu)於終末(mo)分(fen)化細胞；屬(shu)於不增殖(zhi)細胞群(qun)

消化液(ye) 利(li)多(duo)ka因(yin)（12mM）

培(pei)養(yang)條件(jian) 氣(qi)相(xiang)：空(kong)氣，95%；CO2，5%

兔腹腔(qiang)巨(ju)噬分(fen)離自(zi)腹腔(qiang)；腹腔(qiang)，即軀(qu)幹腹部(bu)的腔(qiang)，內(nei)襯腹膜(mo)，由體壁(bi)、橫(heng)膈膜(mo)和盆(pen)底(di)圍成，其(qi)內(nei)容納(na)胃、肝(gan)、膽囊(nang)、脾(pi)臟(zang)、胰(yi)、腎臟、腸(chang)、闌尾(wei)、膀(pang)胱(guang)、泌(mi)尿(niao)系(xi)和婦(fu)科(ke)(子(zi)宮、附(fu)件(jian))等其(qi)他(ta)內(nei)臟器官。巨(ju)噬細(xi)胞(bao)屬(shu)免疫細(xi)胞(bao)，有多(duo)種功(gong)能，是(shi)研(yan)究細(xi)胞(bao)吞(tun)噬(shi)、細(xi)胞免疫和分(fen)子(zi)免疫學(xue)的重(zhong)要對象。巨(ju)噬細(xi)胞(bao)較(jiao)易獲(huo)得(de)，便(bian)於培(pei)養，並(bing)可(ke)進(jin)行(xing)純化。巨(ju)噬細(xi)胞(bao)屬(shu)不繁殖(zhi)細胞群(qun)，在條件(jian)適(shi)宜下(xia)可生(sheng)活2-3周，多(duo)用做(zuo)原代(dai)培養(yang)，難以(yi)長(chang)期(qi)生(sheng)存(cun)。巨(ju)噬細(xi)胞(bao)(Macrophages)是(shi)壹種(zhong)位(wei)於組織內(nei)的白(bai)血球，源(yuan)自單(dan)核細(xi)胞，而單核細胞(bao)又(you)來(lai)源(yuan)於骨(gu)髓中的前體細(xi)胞(bao)。巨(ju)噬細(xi)胞(bao)和單(dan)核(he)細(xi)胞皆為吞(tun)噬(shi)細(xi)胞，在脊椎動(dong)物體內(nei)參與非特異(yi)性(xing)防衛(先天性免疫)和特(te)異(yi)性(xing)防衛(細(xi)胞免疫)。它(ta)們(men)的(de)主(zhu)要功能(neng)是(shi)以(yi)固定細胞(bao)或(huo)遊離細(xi)胞的(de)形式(shi)對細胞(bao)殘(can)片(pian)及(ji)病原體進(jin)行(xing)噬菌作用(yong)(即吞(tun)噬(shi)以(yi)及(ji)消化)，並(bing)激(ji)活淋巴球或(huo)其他(ta)免疫細(xi)胞(bao)，令(ling)其對病原體作出(chu)反(fan)應(ying)。巨(ju)噬細(xi)胞(bao)功(gong)能及其(qi)在疾病發生過程中(zhong)的(de)作用(yong)是(shi)目(mu)前(qian)研(yan)究的(de)熱(re)點(dian)問題(ti)之壹；腹腔(qiang)巨(ju)噬細(xi)胞(bao)的(de)吞(tun)噬(shi)、免疫和分(fen)泌(mi)作用(yong)都十分(fen)活躍，有重(zhong)要防禦(yu)功能。
方(fang)法(fa)簡介(jie)：

公(gong)司(si)實(shi)驗(yan)室分(fen)離的(de)兔腹腔(qiang)巨(ju)噬采(cai)用(yong)反(fan)復(fu)往(wang)腹腔(qiang)註(zhu)射(she)培養(yang)基並(bing)抽取的(de)方(fang)法(fa)結(jie)合差(cha)速(su)貼(tie)壁(bi)制備(bei)而來(lai)，細(xi)胞(bao)總量約為5×10?cells/瓶(ping)。
質(zhi)量檢測(ce)：

公(gong)司(si)實(shi)驗(yan)室分(fen)離的(de)兔腹腔(qiang)巨(ju)噬經(jing)CD68免疫熒光鑒定，純度(du)可(ke)達(da)90%以(yi)上(shang)，且(qie)不含有HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原(yuan)體、細(xi)菌(jun)、酵(jiao)母(mu)和真(zhen)菌(jun)等。

壹、細(xi)胞(bao)培(pei)養

1取材(cai) 在無菌環(huan)境下(xia)從(cong)機體取出(chu)某(mou)種(zhong)組織細(xi)胞(bao)（視(shi)實(shi)驗(yan)目的(de)而定），經(jing)過壹定的處(chu)理(li)（如(ru)消化分(fen)散細胞、分離等）後(hou)接(jie)入(ru)培(pei)養器血中(zhong)，這(zhe)壹過(guo)程(cheng)稱(cheng)為取材(cai)。如(ru)是(shi)細(xi)胞(bao)株(zhu)的擴(kuo)大(da)培養則(ze)無(wu)取材(cai)這壹過(guo)程(cheng)。機(ji)體取出(chu)的(de)組織細(xi)胞(bao)的(de)培(pei)養稱(cheng)為原代培養(yang)。2培(pei)養(yang) 將取得(de)的組織細(xi)胞(bao)接(jie)入(ru)培養(yang)瓶(ping)或(huo)培養板(ban)中的(de)過程(cheng)稱為培養。3凍存(cun)及(ji)復(fu)蘇(su)（可(ke)參閱(yue)後(hou)面(mian)有關(guan)章(zhang)節(jie)）為了(le)保存細(xi)胞(bao)，特(te)別是(shi)不易獲(huo)得(de)的(de)突變(bian)型細(xi)胞(bao)或(huo)細胞株(zhu)，要將細胞凍存(cun)。凍(dong)存(cun)的(de)溫(wen)度壹般用(yong)液(ye)氮(dan)的(de)溫(wen)度－196℃，將細胞收(shou)集(ji)至(zhi)凍(dong)存(cun)管中加入(ru)含保護(hu)劑(ji)（壹般為二甲(jia)亞碸(feng)或(huo)甘油）的培(pei)養(yang)基，以(yi)壹定的冷(leng)卻(que)速(su)度(du)凍(dong)存(cun)，最(zui)終保存於液(ye)氮(dan)中(zhong)。在極低的溫(wen)度下(xia)，細胞(bao)保存的(de)時(shi)間幾乎(hu)是(shi)無(wu)限(xian)的(de)。復蘇(su)壹般采(cai)用(yong)快融方(fang)法(fa)，即從(cong)液(ye)氮(dan)中(zhong)取出(chu)凍(dong)存(cun)管後，立(li)即放(fang)入(ru)37℃水中，使(shi)之在壹分(fen)鐘內(nei)迅速(su)融(rong)解(jie)。然(ran)後(hou)將細胞轉(zhuan)入培養器皿(min)中(zhong)進(jin)行(xing)培養。

二、原代(dai)細(xi)胞分離

凡(fan)是(shi)來(lai)源(yuan)於胚胎(tai)、組織器官及(ji)外(wai)周血，經(jing)特殊(shu)分離方(fang)法(fa)制備(bei)而來(lai)的(de)原(yuan)初培養的(de)細(xi)胞稱(cheng)之為原代細胞(bao)。1懸(xuan)浮細胞(bao)的分(fen)離方(fang)法(fa)組織材(cai)料(liao)若來(lai)自(zi)血液(ye)、羊(yang)水(shui)、胸(xiong)水(shui)或(huo)腹水(shui)的(de)懸液(ye)材(cai)料(liao)，的(de)方(fang)法(fa)是(shi)采(cai)用(yong)1000r/min的(de)低速離心(xin)10分(fen)鐘。經(jing)離心(xin)後(hou)由於各種(zhong)細胞的比重(zhong)不同(tong)可在分層液(ye)中(zhong)形(xing)成(cheng)不同(tong)層，這(zhe)樣(yang)可(ke)根(gen)據需要收(shou)獲(huo)目(mu)的(de)細胞(bao)。2實(shi)體組織材(cai)料(liao)的(de)分(fen)離方(fang)法(fa)對於實(shi)體組織材(cai)料(liao)，由於細(xi)胞間結(jie)合緊(jin)密，為了(le)使(shi)組織中(zhong)的(de)細(xi)胞(bao)充分(fen)分(fen)散，形成細胞(bao)懸(xuan)液(ye)，可(ke)采(cai)用(yong)機(ji)械分散法(fa)（物理(li)裂解(jie)）和消化分(fen)離法(fa)。

三、細(xi)胞(bao)增殖(zhi)檢測(ce)技術(shu)

目(mu)前(qian)主(zhu)要有兩(liang)種(zhong)用於檢(jian)測(ce)細胞(bao)增殖(zhi)能力(li)的方(fang)法(fa)。壹種(zhong)是(shi)直(zhi)接(jie)的方(fang)法(fa)，通(tong)過(guo)直(zhi)接(jie)測(ce)定進(jin)行(xing)分裂

的(de)細(xi)胞數來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞的增殖(zhi)能力(li)。另壹種(zhong)是(shi)間接的(de)方(fang)法(fa)，即細胞活力(li)（cell viability）檢測(ce)方(fang)法(fa)，通(tong)過(guo)檢(jian)測(ce)樣(yang)品(pin)中健康(kang)細(xi)胞的(de)數目(mu)來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞的增殖(zhi)能力(li)。顯(xian)然(ran)，細(xi)胞(bao)活力(li)檢測(ce)法(fa)並(bing)不能最(zui)終證明檢(jian)測(ce)樣(yang)品(pin)中的細胞是(shi)否在增殖(zhi)。如(ru)細胞在某壹培(pei)養(yang)條件(jian)下(xia)會自(zi)發啟(qi)動(dong)雕亡程(cheng)序(xu)，但藥(yao)物(wu)的(de)幹擾可抑制雕亡的(de)發生；這時(shi)若采用(yong)細胞(bao)活力(li)檢測(ce)法(fa)，顯(xian)然(ran)可(ke)以(yi)區分兩(liang)種條件(jian)下(xia)的細(xi)胞(bao)數量，但我們(men)並(bing)不能從(cong)藥物幹擾組細胞(bao)數大(da)於對照(zhao)組的事(shi)實(shi)說(shuo)明藥(yao)物(wu)可(ke)促進(jin)細(xi)胞(bao)增殖(zhi)的結(jie)論。所以(yi)最(zui)直(zhi)接(jie)的證據應該(gai)采(cai)用方(fang)法(fa)壹。

取材(cai)：首(shou)先，用培養(yang)液(ye)濕潤所取的(de)組織材(cai)料(liao)，並(bing)用(yong)鋒利的眼科(ke)剪(jian)去除附(fu)在其上的(de)脂肪(fang)和結(jie)締組織。接(jie)著(zhe)用(yong)平衡(heng)液(ye)（如(ru)PBS或(huo)Hanks液(ye)）漂(piao)洗(xi)，再用眼科(ke)彎(wan)剪(jian)將組織塊剪(jian)成小塊。多(duo)次用PBS或(huo)Hanks液(ye)漂(piao)洗(xi)，直(zhi)到(dao)液(ye)體清亮(liang)、無油滴(di)為止。

接(jie)種(zhong)：用濕潤的吸管吸取切(qie)碎(sui)的組織塊，輕輕吹到培(pei)養瓶(ping)皿(min)中(zhong)，並(bing)按(an)壹定間距均(jun)勻放(fang)在培養瓶(ping)底(di)壁上。註(zhu)意不要過多(duo)，確(que)保組織塊切面(mian)貼(tie)在培養瓶(ping)底(di)壁上。

培(pei)養(yang)：將培養瓶翻(fan)轉(zhuan)，使(shi)瓶(ping)底(di)朝上，在種植了(le)組織塊壹側(ce)的(de)對側面(mian)加足培(pei)養(yang)液(ye)，避免組織塊與培養液(ye)接(jie)觸(chu)，然(ran)後(hou)塞(sai)緊瓶(ping)塞(sai)。將種植了(le)組織塊的壹側(ce)朝(chao)上(shang)，靜置(zhi)於37℃培(pei)養箱(xiang)中(zhong)。待組織塊貼壁(bi)1到(dao)3小時(shi)後(hou)翻瓶，使(shi)貼(tie)壁的(de)組織塊浸(jin)沒(mei)在培養液(ye)中(zhong)，繼(ji)續(xu)靜置。換液(ye)：每(mei)隔(ge)2到3天更換壹次培養(yang)液(ye)，或(huo)者根(gen)據培養瓶種(zhong)顏(yan)色的變化確(que)定換液(ye)時(shi)間。

壹、原(yuan)代(dai)細(xi)胞計數

將血球計數板(ban)及蓋(gai)片用(yong)擦(ca)試(shi)幹凈，並(bing)將蓋片蓋在計數板(ban)上。

將細胞懸液(ye)吸(xi)出(chu)少(shao)許，滴(di)加(jia)在蓋片邊緣(yuan)，使(shi)懸(xuan)液(ye)充(chong)滿(man)蓋(gai)片(pian)和計數板(ban)之間。

靜(jing)置(zhi)3分鐘。

鏡(jing)下(xia)觀(guan)察(cha)，計算(suan)計數板(ban)四大(da)格細胞總數，壓線細胞只(zhi)計左側(ce)和上(shang)方(fang)的(de)。然(ran)後(hou)按(an)下(xia)式計算(suan)：

細(xi)胞(bao)數/ml＝4大(da)格細胞總數/ 4×10000

註(zhu)意：鏡(jing)下(xia)偶見(jian)由兩個以(yi)上(shang)細(xi)胞組成的(de)細(xi)胞(bao)團，應(ying)按(an)單個細(xi)胞(bao)計算(suan)，若細胞(bao)團占10%以(yi)上(shang)，說(shuo)明分(fen)散不好，需(xu)重(zhong)新(xin)制備(bei)細胞(bao)懸液(ye)。

二、原代(dai)細(xi)胞活力(li)

將細胞懸液(ye)以(yi)0.5ml加(jia)入(ru)試管中。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺(tai)盼(pan)蘭染(ran)液(ye)，染(ran)色2壹3分(fen)鐘。

吸(xi)取少(shao)許懸(xuan)液(ye)塗於載(zai)玻(bo)片上，加(jia)上(shang)蓋片(pian)。

鏡(jing)下(xia)取幾個任意視(shi)野分(fen)別計死細(xi)胞(bao)和活細胞數，計細胞活力(li)。

死細(xi)胞(bao)能(neng)被(bei)臺(tai)盼(pan)蘭染(ran)上色，鏡(jing)下(xia)可見(jian)深蘭色的細胞，活細胞不被(bei)染(ran)色，鏡(jing)下(xia)呈無(wu)色透(tou)明狀。

活力(li)測(ce)定可以(yi)和細(xi)胞(bao)計數合起(qi)來(lai)進(jin)行(xing)，但要考(kao)慮到(dao)染(ran)液(ye)對原細(xi)胞懸液(ye)的(de)加(jia)倍(bei)稀釋作用(yong)。