【概要(yao)描述(shu)】兔(tu)骨骼(ge)肌細胞的相(xiang)關產品：HULEC-5a人肺微血管(guan)內皮(pi)細胞(bao)兔原(yuan)代(dai)軟骨細(xi)胞(bao)兔原代(dai)小(xiao)腸(chang)平(ping)滑肌細胞(bao)小(xiao)鼠(shu)原(yuan)代(dai)骨髓(sui)單核細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)原(yuan)代(dai)胎盤間(jian)充質(zhi)幹(gan)細胞(bao)小(xiao)鼠(shu)原(yuan)代(dai)結膜(mo)囊成(cheng)纖維(wei)細胞(bao)兔(tu)原代(dai)基質(zhi)細胞人原(yuan)代(dai)乳腺(xian)成(cheng)纖維(wei)細胞(bao)大鼠原(yuan)代(dai)骨髓(sui)間(jian)充質(zhi)幹(gan)細胞(bao)大鼠原(yuan)代(dai)肺微血管(guan)周(zhou)細胞(bao)

兔(tu)骨骼(ge)肌細(xi)胞

包(bao)被條件 PLL（0.1mg/ml）

培(pei)養(yang)基(ji) 含FBS、生長添(tian)加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每(mei)2-3天(tian)換液壹(yi)次

生長特性(xing) 貼(tie)壁

細(xi)胞形(xing)態 成(cheng)纖維(wei)細胞(bao)樣(yang)

傳(chuan)代(dai)特性(xing) 可(ke)傳2-3代(dai)

消化(hua)液(ye) 0.25%yi蛋(dan)白酶

培(pei)養(yang)條(tiao)件 氣相(xiang)：空氣，95%；CO2，5%

兔(tu)骨骼(ge)肌分(fen)離(li)自(zi)四(si)肢(zhi)肌肉(rou)組(zu)織(zhi)；骨(gu)骼(ge)肌(ji)又稱橫紋(wen)肌，肌(ji)肉中(zhong)的壹(yi)種(zhong)，約占(zhan)全身(shen)重(zhong)量的40%。骨(gu)骼肌(ji)纖維(wei)為長柱形(xing)的多(duo)核(he)細胞(bao)，肌膜的外面有(you)基膜(mo)緊(jin)密貼(tie)附。屬於(yu)橫紋(wen)肌，橫紋(wen)肌還(hai)包(bao)括心(xin)肌(ji)與(yu)內臟橫紋(wen)肌，其中(zhong)骨骼(ge)肌主要分布於(yu)四(si)肢(zhi)。每塊(kuai)肌(ji)肉(rou)都是(shi)具有(you)壹(yi)定形(xing)態、結(jie)構和功能的器(qi)官(guan)，有(you)豐富(fu)的血(xue)管(guan)、淋(lin)巴(ba)分布，在(zai)軀(qu)體神(shen)經(jing)支(zhi)配(pei)下(xia)收縮或(huo)舒張(zhang)，進(jin)行(xing)隨(sui)意運(yun)動。肌肉(rou)可(ke)根(gen)據(ju)共(gong)形(xing)狀(zhuang)、大小(xiao)、位置、起(qi)止(zhi)點(dian)、纖維方(fang)向(xiang)和作用(yong)等命(ming)名(ming)。依形(xing)態命(ming)名(ming)的如(ru)斜(xie)方(fang)肌(ji)、菱形(xing)肌(ji)、三角肌(ji)、梨(li)狀肌(ji)等(deng)。骨(gu)骼(ge)肌細胞(bao)呈(cheng)纖維(wei)狀(zhuang)，不(bu)分支(zhi)，有(you)明(ming)顯橫紋(wen)，核很(hen)多，且(qie)都位於(yu)細(xi)胞膜下(xia)方。肌(ji)細(xi)胞(bao)內有(you)許多(duo)沿(yan)細(xi)胞長軸平(ping)行(xing)排列(lie)的細(xi)絲狀肌(ji)原(yuan)纖維。每(mei)壹(yi)肌原纖(xian)維(wei)都有(you)相(xiang)間(jian)排列(lie)的明(ming)帶(dai)（Ⅰ帶(dai)）及(ji)暗(an)帶(dai)（A帶(dai)）。明(ming)帶(dai)染(ran)色較(jiao)淺，而(er)暗(an)帶(dai)染(ran)色較(jiao)深。暗(an)帶(dai)中(zhong)間(jian)有(you)壹(yi)條較明(ming)亮的線(xian)稱(cheng)H線。H線(xian)的中(zhong)部(bu)有(you)壹(yi)M線。明(ming)帶(dai)中(zhong)間(jian)，有(you)壹(yi)條較暗(an)的線(xian)稱(cheng)為Z線(xian)。兩個(ge)Z線(xian)之(zhi)間(jian)的區(qu)段(duan)，叫(jiao)做(zuo)壹(yi)個(ge)肌(ji)節(jie)。骨(gu)骼肌細胞也(ye)稱(cheng)橫紋(wen)肌細(xi)胞，細(xi)胞呈(cheng)纖維(wei)狀(zhuang)，不(bu)分支(zhi)，有(you)明(ming)顯橫紋(wen)，核很(hen)多，且(qie)都位於(yu)細(xi)胞膜下(xia)方，細(xi)胞(bao)多(duo)呈(cheng)梭行(xing)，具有(you)壹(yi)定的方(fang)向(xiang)性。骨(gu)骼肌細胞原代(dai)分離(li)培(pei)養(yang)3天(tian)後，可(ke)見細(xi)胞(bao)貼(tie)壁伸(shen)展，細(xi)胞形(xing)態大小(xiao)不(bu)壹(yi)，呈(cheng)梭形(xing)、不(bu)規(gui)則形(xing)、三(san)角形(xing)或(huo)扇形(xing)，核(he)卵(luan)圓(yuan)形(xing)、居(ju)中；2周(zhou)後細(xi)胞匯合(he)，多(duo)數(shu)細胞(bao)伸(shen)展呈(cheng)長梭形(xing)，胞(bao)漿豐富(fu)，有(you)分枝狀突起(qi)，細胞(bao)平(ping)行(xing)排列(lie)成(cheng)單層或(huo)部(bu)分(fen)區域多層重疊生長，高低起(qi)伏；細(xi)胞(bao)密度低時，常交(jiao)織(zhi)成(cheng)網狀(zhuang)；密度高(gao)時(shi)，則排列(lie)為旋渦(wo)狀(zhuang)或(huo)柵(zha)欄狀(zhuang)。傳(chuan)代(dai)後細(xi)胞生長較快，4-6天(tian)即可(ke)匯合(he)，並(bing)保持(chi)上(shang)述(shu)形(xing)態學(xue)特征(zheng)和生長特點(dian)。
方(fang)法簡介(jie)：

公(gong)司實(shi)驗(yan)室分離(li)的兔(tu)骨(gu)骼肌(ji)采用(yong)膠(jiao)原(yuan)酶消化(hua)法制備而來，細胞總量約為(wei)5×10?cells/瓶。
質(zhi)量檢測(ce)：

公(gong)司實(shi)驗(yan)室分離(li)的兔(tu)骨(gu)骼肌(ji)經(jing)α-Sarcometric actin免疫熒光(guang)鑒定，純度可(ke)達90%以(yi)上(shang)，且(qie)不含有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原體(ti)、細(xi)菌(jun)、酵母和真(zhen)菌(jun)等。

壹(yi)、細胞培(pei)養(yang)

1取(qu)材(cai) 在(zai)無菌(jun)環境下(xia)從機體(ti)取出(chu)某種(zhong)組織(zhi)細(xi)胞(bao)（視(shi)實(shi)驗(yan)目的而(er)定(ding)），經(jing)過壹(yi)定的處(chu)理(li)（如(ru)消化(hua)分(fen)散細(xi)胞、分離(li)等(deng)）後(hou)接(jie)入(ru)培(pei)養(yang)器(qi)血中(zhong)，這壹(yi)過程稱為取材(cai)。如(ru)是(shi)細胞(bao)株的擴大培養(yang)則無取(qu)材(cai)這(zhe)壹(yi)過程。機體取出(chu)的組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)的培(pei)養(yang)稱(cheng)為原代(dai)培養(yang)。2培(pei)養(yang) 將(jiang)取得的組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)接(jie)入(ru)培(pei)養(yang)瓶或(huo)培養(yang)板中的過程稱為培養(yang)。3凍(dong)存(cun)及復蘇（可(ke)參閱(yue)後(hou)面(mian)有(you)關章節）為(wei)了(le)保存(cun)細胞，特(te)別(bie)是(shi)不易(yi)獲得的突變型(xing)細胞或(huo)細胞(bao)株(zhu)，要(yao)將細胞(bao)凍(dong)存(cun)。凍(dong)存(cun)的溫(wen)度壹(yi)般用(yong)液氮(dan)的溫(wen)度－196℃，將(jiang)細(xi)胞收集(ji)至(zhi)凍(dong)存(cun)管(guan)中加(jia)入含保護(hu)劑(ji)（壹(yi)般為二(er)甲亞(ya)碸(feng)或(huo)甘油(you)）的培(pei)養(yang)基(ji)，以壹(yi)定的冷(leng)卻(que)速度凍(dong)存(cun)，最終保存(cun)於(yu)液(ye)氮中。在(zai)極低的溫(wen)度下(xia)，細胞(bao)保存(cun)的時(shi)間(jian)幾(ji)乎(hu)是(shi)無限(xian)的。復蘇壹(yi)般采用(yong)快融(rong)方(fang)法，即從液氮(dan)中取(qu)出(chu)凍(dong)存(cun)管(guan)後，立即放(fang)入37℃水(shui)中，使(shi)之(zhi)在(zai)壹(yi)分鐘(zhong)內迅速(su)融(rong)解。然(ran)後將(jiang)細胞(bao)轉入培(pei)養(yang)器(qi)皿中(zhong)進(jin)行(xing)培養(yang)。

二(er)、原代(dai)細胞(bao)分離(li)

凡(fan)是(shi)來源(yuan)於(yu)胚(pei)胎(tai)、組(zu)織(zhi)器(qi)官(guan)及外周(zhou)血，經(jing)特殊(shu)分(fen)離(li)方(fang)法制備而來的原(yuan)初(chu)培(pei)養(yang)的細(xi)胞(bao)稱之(zhi)為原代(dai)細胞(bao)。1懸浮細胞(bao)的分(fen)離(li)方(fang)法組織(zhi)材(cai)料(liao)若(ruo)來(lai)自(zi)血液、羊(yang)水、胸(xiong)水(shui)或(huo)腹水(shui)的懸液材(cai)料(liao)，的方(fang)法是(shi)采用(yong)1000r/min的低速離(li)心(xin)10分(fen)鐘(zhong)。經(jing)離(li)心(xin)後(hou)由於(yu)各(ge)種(zhong)細胞的比重不(bu)同(tong)可(ke)在(zai)分(fen)層液中(zhong)形(xing)成(cheng)不同(tong)層，這樣(yang)可(ke)根(gen)據(ju)需(xu)要收獲目的細(xi)胞(bao)。2實(shi)體(ti)組織(zhi)材(cai)料(liao)的分(fen)離(li)方(fang)法對於(yu)實(shi)體(ti)組織(zhi)材(cai)料(liao)，由於(yu)細(xi)胞間(jian)結(jie)合(he)緊(jin)密，為(wei)了(le)使(shi)組(zu)織(zhi)中(zhong)的細(xi)胞(bao)充分(fen)分(fen)散，形(xing)成(cheng)細胞(bao)懸液，可(ke)采用(yong)機械(xie)分散(san)法（物理裂(lie)解）和消化(hua)分(fen)離(li)法。

三(san)、細胞(bao)增殖(zhi)檢(jian)測(ce)技(ji)術(shu)

目(mu)前主要有(you)兩種(zhong)用(yong)於(yu)檢(jian)測細胞增(zeng)殖(zhi)能力的方(fang)法。壹(yi)種(zhong)是(shi)直接(jie)的方(fang)法，通過直(zhi)接(jie)測(ce)定(ding)進(jin)行(xing)分裂(lie)

的細(xi)胞(bao)數(shu)來評(ping)價(jia)細胞(bao)的增(zeng)殖(zhi)能力。另壹(yi)種(zhong)是(shi)間(jian)接(jie)的方(fang)法，即細胞(bao)活(huo)力（cell viability）檢測(ce)方(fang)法，通過檢(jian)測樣(yang)品(pin)中(zhong)健康細胞的數(shu)目來(lai)評價(jia)細胞(bao)的增(zeng)殖(zhi)能力。顯然(ran)，細胞(bao)活(huo)力檢測(ce)法並(bing)不能最終證明(ming)檢測(ce)樣(yang)品(pin)中(zhong)的細(xi)胞(bao)是(shi)否(fou)在(zai)增(zeng)殖(zhi)。如(ru)細胞(bao)在(zai)某壹(yi)培養(yang)條(tiao)件下(xia)會自發啟動雕(diao)亡(wang)程序，但(dan)藥物的幹(gan)擾可(ke)抑制(zhi)雕(diao)亡(wang)的發生；這(zhe)時若采(cai)用(yong)細胞(bao)活(huo)力檢測(ce)法，顯然(ran)可(ke)以區(qu)分(fen)兩種(zhong)條件下(xia)的細(xi)胞(bao)數(shu)量，但(dan)我們(men)並(bing)不能從藥物幹(gan)擾組細胞(bao)數(shu)大於(yu)對(dui)照組的事(shi)實(shi)說明(ming)藥物可(ke)促進(jin)細(xi)胞增殖(zhi)的結(jie)論。所以(yi)最直(zhi)接(jie)的證(zheng)據(ju)應(ying)該(gai)采(cai)用(yong)方法壹(yi)。

取(qu)材(cai)：首(shou)先，用(yong)培養(yang)液(ye)濕潤所(suo)取(qu)的組(zu)織(zhi)材(cai)料(liao)，並(bing)用(yong)鋒利的眼科剪(jian)去(qu)除(chu)附在(zai)其上(shang)的脂(zhi)肪和結締(di)組(zu)織(zhi)。接(jie)著(zhe)用(yong)平衡(heng)液（如(ru)PBS或(huo)Hanks液）漂(piao)洗，再用(yong)眼科彎剪將(jiang)組(zu)織(zhi)塊(kuai)剪(jian)成(cheng)小(xiao)塊(kuai)。多(duo)次用(yong)PBS或(huo)Hanks液漂(piao)洗，直到液(ye)體(ti)清(qing)亮、無油(you)滴(di)為(wei)止(zhi)。

接(jie)種(zhong)：用(yong)濕潤(run)的吸(xi)管(guan)吸(xi)取切碎的組(zu)織(zhi)塊(kuai)，輕(qing)輕(qing)吹到培(pei)養(yang)瓶皿中(zhong)，並(bing)按壹(yi)定間(jian)距(ju)均(jun)勻放(fang)在(zai)培(pei)養(yang)瓶底壁上(shang)。註(zhu)意(yi)不(bu)要(yao)過多(duo)，確保組(zu)織(zhi)塊(kuai)切面貼(tie)在(zai)培(pei)養(yang)瓶底壁上(shang)。

培(pei)養(yang)：將(jiang)培養(yang)瓶翻轉(zhuan)，使(shi)瓶底朝(chao)上(shang)，在(zai)種(zhong)植(zhi)了(le)組(zu)織(zhi)塊(kuai)壹(yi)側(ce)的對(dui)側(ce)面加(jia)足培(pei)養(yang)液(ye)，避免組織(zhi)塊(kuai)與(yu)培(pei)養(yang)液(ye)接(jie)觸(chu)，然(ran)後塞緊(jin)瓶塞。將(jiang)種(zhong)植(zhi)了(le)組(zu)織(zhi)塊(kuai)的壹(yi)側(ce)朝上(shang)，靜置於(yu)37℃培(pei)養(yang)箱中。待(dai)組織(zhi)塊(kuai)貼(tie)壁1到3小(xiao)時(shi)後(hou)翻瓶，使(shi)貼(tie)壁的組(zu)織(zhi)塊(kuai)浸(jin)沒(mei)在(zai)培(pei)養(yang)液(ye)中，繼續靜置。換液：每隔(ge)2到3天(tian)更換壹(yi)次培養(yang)液(ye)，或(huo)者(zhe)根(gen)據(ju)培(pei)養(yang)瓶種(zhong)顏(yan)色的變(bian)化(hua)確定(ding)換液時間(jian)。

壹(yi)、原代(dai)細胞(bao)計數(shu)

將(jiang)血球計(ji)數(shu)板及蓋片(pian)用(yong)擦試(shi)幹(gan)凈，並(bing)將蓋(gai)片(pian)蓋在(zai)計(ji)數(shu)板上(shang)。

將(jiang)細胞(bao)懸液吸(xi)出(chu)少許，滴(di)加(jia)在(zai)蓋(gai)片(pian)邊(bian)緣，使(shi)懸液充滿(man)蓋(gai)片(pian)和計數(shu)板之間(jian)。

靜置3分鐘(zhong)。

鏡(jing)下(xia)觀察，計算(suan)計數(shu)板四(si)大格(ge)細(xi)胞總數(shu)，壓線(xian)細胞只計左側(ce)和上(shang)方(fang)的。然(ran)後按(an)下(xia)式(shi)計(ji)算(suan)：

細(xi)胞數(shu)/ml＝4大格(ge)細(xi)胞總數(shu)/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡(jing)下(xia)偶見(jian)由兩個(ge)以(yi)上(shang)細(xi)胞組成(cheng)的細(xi)胞(bao)團，應(ying)按(an)單個(ge)細(xi)胞(bao)計(ji)算(suan)，若細(xi)胞團占(zhan)10%以上(shang)，說明(ming)分散(san)不好(hao)，需(xu)重新制備細胞懸液。

二(er)、原代(dai)細胞(bao)活(huo)力

將(jiang)細胞(bao)懸液以0.5ml加(jia)入試(shi)管(guan)中。

加(jia)入0.5ml 0.4%臺盼蘭(lan)染液，染色(se)2壹(yi)3分鐘(zhong)。

吸(xi)取少許懸液塗(tu)於(yu)載(zai)玻(bo)片(pian)上(shang)，加(jia)上(shang)蓋(gai)片(pian)。

鏡(jing)下(xia)取幾(ji)個(ge)任意視(shi)野(ye)分(fen)別計(ji)死(si)細(xi)胞(bao)和活(huo)細胞數(shu)，計細(xi)胞活(huo)力。

死(si)細(xi)胞(bao)能被臺盼蘭(lan)染上(shang)色(se)，鏡(jing)下(xia)可(ke)見深(shen)蘭(lan)色(se)的細(xi)胞(bao)，活(huo)細胞不被染色，鏡(jing)下(xia)呈(cheng)無色(se)透明(ming)狀。

活(huo)力測定(ding)可(ke)以和細胞計數(shu)合(he)起(qi)來進(jin)行(xing)，但(dan)要考慮到染(ran)液(ye)對原(yuan)細胞懸液的加(jia)倍稀(xi)釋作用(yong)。