【概要描(miao)述】豬主(zhu)動(dong)脈(mai)內皮細胞的(de)相(xiang)關產(chan)品：A375+EGFP人惡性(xing)黑(hei)色(se)瘤(liu)細胞兔原(yuan)代少突小(xiao)膠(jiao)質細胞人原(yuan)代胎(tai)盤絨毛膜間(jian)質細胞兔原(yuan)代椎(zhui)體(ti)終(zhong)板(ban)軟(ruan)骨(gu)細胞小鼠原(yuan)代嗅鞘(qiao)細胞人原(yuan)代結膜(mo)上皮(pi)細胞大鼠原(yuan)代脾(pi)源(yuan)性(xing)內皮祖(zu)細胞人原(yuan)代毛囊(nang)外(wai)根(gen)鞘細胞兔原(yuan)代腎小(xiao)球內皮細胞貓原(yuan)代小腸(chang)粘膜(mo)上皮(pi)細胞

豬主(zhu)動(dong)脈(mai)內皮細胞

包(bao)被(bei)條(tiao)件 PLL（0.1mg/ml），明膠(jiao)（0.1%）

培(pei)養(yang)基(ji) 含(han)FBS、生(sheng)長(chang)添加(jia)劑、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液頻(pin)率(lv) 每2-3天(tian)換液壹(yi)次(ci)

生(sheng)長(chang)特性(xing) 貼壁(bi)

細胞形(xing)態(tai) 內皮細胞樣(yang)

傳(chuan)代(dai)特性(xing) 可(ke)傳(chuan)2-3代(dai)

消(xiao)化液 0.25%yi蛋(dan)白(bai)酶(mei)

培(pei)養(yang)條(tiao)件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

豬主(zhu)動(dong)脈(mai)內皮分離自(zi)主(zhu)動(dong)脈(mai)組織(zhi)；主動(dong)脈(mai)是體(ti)循(xun)環(huan)的(de)動(dong)脈(mai)主幹(gan)。其(qi)運行路(lu)徑為(wei)：升主動脈(mai)起於(yu)左(zuo)心(xin)室，至(zhi)右(you)側第2胸(xiong)肋(lei)關(guan)節高(gao)度移(yi)行為(wei)主動(dong)脈(mai)弓，弓行向(xiang)左後至第4胸(xiong)椎(zhui)體(ti)下(xia)緣(yuan)移(yi)行為(wei)降主(zhu)動脈(mai)；在第12胸(xiong)椎(zhui)體(ti)高(gao)度穿(chuan)膈(ge)的(de)主(zhu)動脈(mai)裂孔(kong)移(yi)行為(wei)腹主(zhu)動脈(mai)，以(yi)上為(wei)胸主(zhu)動脈(mai)，至第4腰椎(zhui)體(ti)下(xia)緣(yuan)分為(wei)左、右(you)髂總(zong)動脈(mai)；髂總(zong)動脈(mai)在骶髂關(guan)節高(gao)度分為(wei)髂內、外(wai)動脈(mai)。主動(dong)脈(mai)內皮細胞是覆蓋(gai)在(zai)主(zhu)動脈(mai)內面的(de)單層(ceng)細胞，可(ke)分泌壹(yi)系列血(xue)管活(huo)性(xing)物質而保(bao)持血(xue)管穩(wen)態，當其(qi)受(shou)到炎(yan)癥或(huo)其(qi)它(ta)因(yin)素(su)刺激後穩態被破壞(huai)而導致(zhi)壹(yi)些(xie)心(xin)血管(guan)疾(ji)病的(de)發生(sheng)。因(yin)此(ci)，主動脈(mai)內皮細胞已成(cheng)為(wei)研究(jiu)心(xin)血管(guan)疾(ji)病發病機(ji)制及治(zhi)療藥物的(de)工(gong)具(ju)。內皮細胞或血管內皮是(shi)壹(yi)薄層(ceng)的(de)專門上皮(pi)細胞，由(you)壹層(ceng)扁平細胞所組成(cheng)。它(ta)形(xing)成(cheng)血管的(de)內壁(bi)，是(shi)血(xue)管(guan)管腔內血液及其(qi)他(ta)血管(guan)壁(bi)（單層(ceng)鱗(lin)狀上皮(pi)）的(de)接(jie)口(kou)。內皮細胞是沿(yan)著(zhe)整個循環(huan)系統，由(you)心(xin)臟直(zhi)至(zhi)最小(xiao)的(de)微血(xue)管(guan)。
方(fang)法簡(jian)介：

公司實(shi)驗室(shi)分離的(de)豬主(zhu)動(dong)脈(mai)內皮采(cai)用yi蛋(dan)白(bai)酶(mei)-膠(jiao)原(yuan)酶(mei)聯合(he)消(xiao)化法結(jie)合(he)差(cha)速(su)貼壁(bi)法、並(bing)通(tong)過內皮細胞專用培(pei)養基(ji)培養(yang)篩選(xuan)制備而來，細胞總量約(yue)為(wei)5×10?cells/瓶。
質量檢(jian)測：

公司實(shi)驗室(shi)分離的(de)豬主(zhu)動(dong)脈(mai)內皮經(jing)CD31免(mian)疫(yi)熒(ying)光鑒(jian)定(ding)，純度可(ke)達(da)90%以(yi)上，且(qie)不(bu)含(han)有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原(yuan)體(ti)、細菌、酵(jiao)母和(he)真菌等(deng)。

壹(yi)、細胞培養

1取(qu)材(cai) 在(zai)無(wu)菌環(huan)境下從機(ji)體(ti)取(qu)出(chu)某(mou)種組織(zhi)細胞（視(shi)實驗目(mu)的(de)而定(ding)），經(jing)過壹(yi)定(ding)的(de)處(chu)理(li)（如消(xiao)化分散(san)細胞、分離等(deng)）後接(jie)入培(pei)養(yang)器(qi)血(xue)中(zhong)，這壹過程稱(cheng)為(wei)取材(cai)。如是細胞株的(de)擴(kuo)大培養(yang)則無(wu)取(qu)材這(zhe)壹過(guo)程。機(ji)體(ti)取(qu)出(chu)的(de)組織(zhi)細胞的(de)培(pei)養稱為(wei)原(yuan)代培養(yang)。2培養 將(jiang)取(qu)得的(de)組織(zhi)細胞接(jie)入培(pei)養(yang)瓶或培(pei)養板中(zhong)的(de)過(guo)程稱(cheng)為(wei)培養(yang)。3凍(dong)存及復蘇（可(ke)參閱後面有(you)關(guan)章(zhang)節）為(wei)了(le)保(bao)存細胞，特別是不(bu)易(yi)獲得的(de)突變(bian)型(xing)細胞或細胞株，要將細胞凍(dong)存。凍(dong)存的(de)溫(wen)度壹(yi)般用液氮的(de)溫(wen)度－196℃，將(jiang)細胞收集(ji)至凍(dong)存管(guan)中(zhong)加入含保(bao)護(hu)劑(ji)（壹般為(wei)二(er)甲亞碸(feng)或甘(gan)油(you)）的(de)培(pei)養基(ji)，以(yi)壹定(ding)的(de)冷(leng)卻速(su)度凍(dong)存，最終(zhong)保(bao)存於(yu)液氮中(zhong)。在極(ji)低(di)的(de)溫(wen)度下(xia)，細胞保(bao)存的(de)時(shi)間(jian)幾乎是(shi)無(wu)限的(de)。復蘇壹般(ban)采(cai)用快(kuai)融方(fang)法，即(ji)從(cong)液氮中(zhong)取出凍(dong)存管(guan)後，立即(ji)放(fang)入(ru)37℃水(shui)中(zhong)，使之在壹分鐘內迅(xun)速(su)融解。然後將細胞轉入(ru)培(pei)養(yang)器(qi)皿中(zhong)進(jin)行培(pei)養。

二(er)、原(yuan)代細胞分離

凡(fan)是(shi)來(lai)源(yuan)於(yu)胚(pei)胎(tai)、組織(zhi)器(qi)官(guan)及外(wai)周血(xue)，經(jing)特殊(shu)分離方(fang)法制備而來的(de)原(yuan)初(chu)培(pei)養的(de)細胞稱之為(wei)原(yuan)代細胞。1懸浮(fu)細胞的(de)分離方(fang)法組織(zhi)材料(liao)若來自(zi)血(xue)液、羊(yang)水(shui)、胸水(shui)或腹(fu)水(shui)的(de)懸液材(cai)料(liao)，的(de)方(fang)法是(shi)采(cai)用1000r/min的(de)低(di)速(su)離(li)心(xin)10分鐘。經(jing)離心(xin)後由(you)於各(ge)種細胞的(de)比重(zhong)不(bu)同(tong)可(ke)在(zai)分層(ceng)液中(zhong)形(xing)成(cheng)不(bu)同(tong)層(ceng)，這(zhe)樣(yang)可(ke)根(gen)據(ju)需(xu)要收獲(huo)目(mu)的(de)細胞。2實體(ti)組織(zhi)材料(liao)的(de)分離方(fang)法對(dui)於(yu)實體(ti)組織(zhi)材料(liao)，由(you)於細胞間(jian)結合(he)緊密，為(wei)了(le)使(shi)組織(zhi)中(zhong)的(de)細胞充(chong)分分散(san)，形(xing)成(cheng)細胞懸液，可(ke)采(cai)用機(ji)械(xie)分散(san)法（物理(li)裂解(jie)）和(he)消(xiao)化分離法。

三(san)、細胞增殖檢測技(ji)術

目(mu)前主(zhu)要有(you)兩(liang)種用於(yu)檢測細胞增殖能力的(de)方(fang)法。壹(yi)種是(shi)直(zhi)接(jie)的(de)方(fang)法，通(tong)過直(zhi)接(jie)測定(ding)進(jin)行分裂

的(de)細胞數來評(ping)價細胞的(de)增(zeng)殖能力。另壹(yi)種是(shi)間(jian)接(jie)的(de)方(fang)法，即(ji)細胞活(huo)力（cell viability）檢測方(fang)法，通(tong)過檢(jian)測樣(yang)品(pin)中(zhong)健康(kang)細胞的(de)數(shu)目(mu)來評(ping)價細胞的(de)增(zeng)殖能力。顯然，細胞活(huo)力檢測法並(bing)不(bu)能(neng)最終(zhong)證明檢(jian)測樣(yang)品(pin)中(zhong)的(de)細胞是否在(zai)增殖。如細胞在某壹培養條件下會(hui)自(zi)發啟(qi)動(dong)雕亡(wang)程序(xu)，但(dan)藥物的(de)幹(gan)擾(rao)可(ke)抑制雕亡(wang)的(de)發生(sheng)；這(zhe)時(shi)若采(cai)用細胞活(huo)力檢測法，顯然可(ke)以(yi)區分兩(liang)種條(tiao)件下的(de)細胞數量，但我們並(bing)不(bu)能(neng)從(cong)藥物幹(gan)擾(rao)組細胞數大於對(dui)照(zhao)組的(de)事實(shi)說(shuo)明藥物可(ke)促(cu)進(jin)細胞增殖的(de)結(jie)論。所(suo)以(yi)最直(zhi)接(jie)的(de)證(zheng)據(ju)應(ying)該(gai)采(cai)用方(fang)法壹(yi)。

取(qu)材(cai)：首先，用培(pei)養液濕潤(run)所(suo)取的(de)組織(zhi)材料(liao)，並(bing)用鋒(feng)利的(de)眼(yan)科剪去除附在其(qi)上的(de)脂肪(fang)和(he)結(jie)締(di)組織(zhi)。接(jie)著用平(ping)衡液（如PBS或Hanks液）漂(piao)洗，再(zai)用眼(yan)科彎剪(jian)將(jiang)組織(zhi)塊(kuai)剪(jian)成小(xiao)塊(kuai)。多(duo)次用PBS或(huo)Hanks液漂(piao)洗，直(zhi)到(dao)液體(ti)清亮、無(wu)油(you)滴(di)為(wei)止(zhi)。

接(jie)種：用濕潤(run)的(de)吸(xi)管吸取切(qie)碎的(de)組織(zhi)塊(kuai)，輕(qing)輕(qing)吹到培(pei)養(yang)瓶皿中(zhong)，並(bing)按壹定(ding)間(jian)距均勻(yun)放在(zai)培(pei)養(yang)瓶底壁(bi)上。註意不(bu)要(yao)過(guo)多，確(que)保(bao)組織(zhi)塊(kuai)切(qie)面貼在培養(yang)瓶底壁(bi)上。

培(pei)養(yang)：將(jiang)培(pei)養瓶翻轉，使(shi)瓶底朝上，在(zai)種植(zhi)了(le)組織(zhi)塊(kuai)壹(yi)側的(de)對(dui)側面加(jia)足培養(yang)液，避(bi)免(mian)組織(zhi)塊(kuai)與培(pei)養液接(jie)觸，然後塞緊瓶塞。將(jiang)種植(zhi)了(le)組織(zhi)塊(kuai)的(de)壹(yi)側朝上，靜(jing)置(zhi)於37℃培(pei)養箱(xiang)中(zhong)。待組織(zhi)塊(kuai)貼壁(bi)1到(dao)3小(xiao)時(shi)後翻瓶，使貼壁(bi)的(de)組織(zhi)塊(kuai)浸(jin)沒在(zai)培(pei)養(yang)液中(zhong)，繼續靜(jing)置(zhi)。換液：每隔2到(dao)3天更(geng)換壹次(ci)培養(yang)液，或(huo)者(zhe)根(gen)據(ju)培養(yang)瓶種顏(yan)色的(de)變(bian)化確(que)定(ding)換液時(shi)間(jian)。

壹(yi)、原(yuan)代細胞計(ji)數(shu)

將(jiang)血(xue)球計(ji)數(shu)板(ban)及蓋(gai)片(pian)用擦(ca)試幹凈，並(bing)將(jiang)蓋(gai)片(pian)蓋(gai)在(zai)計(ji)數(shu)板(ban)上。

將(jiang)細胞懸液吸(xi)出(chu)少(shao)許(xu)，滴加在(zai)蓋(gai)片(pian)邊(bian)緣，使(shi)懸液充(chong)滿蓋(gai)片(pian)和(he)計(ji)數(shu)板(ban)之間(jian)。

靜(jing)置(zhi)3分鐘。

鏡下觀察，計(ji)算(suan)計(ji)數(shu)板(ban)四大格(ge)細胞總數，壓(ya)線細胞只計(ji)左(zuo)側(ce)和(he)上方(fang)的(de)。然後按下式計(ji)算(suan)：

細胞數/ml＝4大格(ge)細胞總數/ 4×10000

註意：鏡下偶見(jian)由(you)兩(liang)個以(yi)上細胞組成(cheng)的(de)細胞團(tuan)，應(ying)按單個(ge)細胞計(ji)算(suan)，若細胞團(tuan)占(zhan)10%以(yi)上，說(shuo)明分散(san)不(bu)好，需(xu)重新(xin)制備細胞懸液。

二(er)、原(yuan)代細胞活(huo)力

將(jiang)細胞懸液以(yi)0.5ml加入(ru)試管中(zhong)。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色(se)2壹3分鐘。

吸(xi)取(qu)少(shao)許(xu)懸液塗於載(zai)玻(bo)片(pian)上，加(jia)上蓋(gai)片(pian)。

鏡下取幾個任(ren)意(yi)視(shi)野分別計(ji)死(si)細胞和(he)活(huo)細胞數，計(ji)細胞活(huo)力。

死(si)細胞能被臺盼蘭染上色(se)，鏡下可(ke)見(jian)深蘭色的(de)細胞，活(huo)細胞不(bu)被(bei)染色(se)，鏡下呈(cheng)無(wu)色(se)透明狀(zhuang)。

活(huo)力測定(ding)可(ke)以(yi)和(he)細胞計(ji)數(shu)合(he)起來(lai)進(jin)行，但(dan)要考(kao)慮到染液對(dui)原(yuan)細胞懸液的(de)加(jia)倍稀釋(shi)作(zuo)用。