【概(gai)要描(miao)述】兔(tu)角膜內(nei)皮(pi)細(xi)胞的相關產品：A375-LUC-EGFP人(ren)惡(e)性(xing)黑(hei)色瘤細胞小鼠原代(dai)心室(shi)心(xin)肌(ji)細胞大(da)鼠原代(dai)心臟微血(xue)管(guan)內(nei)皮(pi)細(xi)胞兔(tu)原代(dai)口腔(qiang)黏膜成纖(xian)維(wei)細胞小鼠原代(dai)小腸粘(zhan)膜上皮(pi)細(xi)胞綿羊原(yuan)代(dai)前(qian)脂肪(fang)細胞（肌(ji)內(nei)來源(yuan)）小(xiao)鼠原代(dai)晶狀體(ti)上(shang)皮(pi)細(xi)胞小鼠原代(dai)真(zhen)皮(pi)毛乳(ru)頭細(xi)胞兔(tu)原代(dai)結膜囊成纖(xian)維(wei)細胞大(da)鼠原代(dai)脾淋(lin)巴細(xi)胞

兔(tu)角膜內(nei)皮(pi)細(xi)胞

包(bao)被條件 PLL（0.1mg/ml），明(ming)膠(jiao)（0.1%）

培養基 含FBS、生長添加(jia)劑、Penicillin、Streptomycin等

換液(ye)頻率(lv) 每2-3天(tian)換液(ye)壹次

生長特性(xing) 貼壁

細胞形(xing)態(tai) 內(nei)皮(pi)細(xi)胞樣(yang)

傳代(dai)特性(xing) 可(ke)傳2-3代(dai)

消(xiao)化液(ye) 0.25%yi蛋白酶

培養條件 氣相：空(kong)氣(qi)，95%；CO2，5%

兔(tu)角膜內(nei)皮(pi)分(fen)離自眼角(jiao)膜組織(zhi)；角膜位於眼(yan)球(qiu)前(qian)壁的(de)壹層透明(ming)膜，約(yue)占(zhan)纖(xian)維(wei)膜的前(qian)1/6，從(cong)後面(mian)看(kan)角膜呈(cheng)正(zheng)圓(yuan)形(xing)，從(cong)前(qian)面(mian)看(kan)為橫(heng)橢(tuo)圓(yuan)形(xing)。角(jiao)膜厚度各部分(fen)不盡相同，中央部最薄(bo)。角(jiao)膜有(you)十(shi)分(fen)敏(min)感的(de)神經末(mo)梢，如(ru)有(you)外物(wu)接(jie)觸角膜，眼瞼(jian)便(bian)會(hui)不由自主地合上以(yi)保護眼睛(jing)。為(wei)了(le)保(bao)持透明(ming)，角(jiao)膜並沒有(you)血(xue)管(guan)，透過外界(jie)空(kong)氣(qi)、淚液(ye)及(ji)房(fang)水獲取(qu)養(yang)份(fen)及(ji)氧氣。角膜分為(wei)五層(ceng)，由前(qian)向後依(yi)次為(wei)：上皮(pi)細(xi)胞層、前(qian)彈力(li)層(ceng)、基質(zhi)層、後彈(dan)力(li)層(ceng)、內(nei)皮(pi)細(xi)胞層。角(jiao)膜的高(gao)度透(tou)明(ming)性(xing)和(he)光學(xue)性(xing)是(shi)正(zheng)常發揮生理功能(neng)的(de)必(bi)要條件之(zhi)壹，而角膜內(nei)皮(pi)細(xi)胞（CEC）在維(wei)持角(jiao)膜的正(zheng)常生理功能(neng)方(fang)面(mian)起(qi)重要作(zuo)用(yong)。角(jiao)膜內(nei)皮(pi)細(xi)胞是(shi)角膜內(nei)層的單層細胞，構成了(le)後彈(dan)力(li)層(ceng)和(he)房水之(zhi)間的(de)物(wu)理(li)屏(ping)障，通過離子(zi)“泵"功(gong)能(neng)調節角(jiao)膜中離(li)子(zi)濃度(du)和(he)水分，維(wei)持角(jiao)膜的半(ban)脫水狀態(tai)，保(bao)證(zheng)角(jiao)膜的正(zheng)常厚度和(he)透明(ming)度(du)。壹旦角(jiao)膜內(nei)皮(pi)細(xi)胞功能(neng)出(chu)現紊(wen)亂(luan)，常導致(zhi)角(jiao)膜水腫(zhong)而(er)使(shi)角(jiao)膜部分(fen)甚至wan全(quan)失(shi)去透(tou)明(ming)性(xing)。角(jiao)膜內(nei)皮(pi)細(xi)胞主要功(gong)能(neng)有(you)：①角膜是(shi)的無(wu)血(xue)管(guan)的組織(zhi)，具(ju)有(you)透明(ming)的(de)特性(xing)和(he)合成許多蛋白的功(gong)能(neng)；②角(jiao)膜內(nei)皮(pi)細(xi)胞對角(jiao)膜透明(ming)性(xing)有(you)重要作(zuo)用(yong)；③角(jiao)膜內(nei)皮(pi)細(xi)胞通過Na+-K+-ATP酶活(huo)性(xing)，維(wei)持角(jiao)膜和(he)房水內(nei)Na+梯度(du)，防(fang)止水分滲入角膜內(nei)，維(wei)持角(jiao)膜實質(zhi)層相對脫水狀態(tai)，維(wei)持透(tou)明(ming)性(xing)。
方法簡(jian)介(jie)：

公司(si)實(shi)驗室(shi)分(fen)離(li)的(de)兔(tu)角膜內(nei)皮(pi)采(cai)用混合膠原酶消(xiao)化結(jie)合內(nei)皮(pi)細(xi)胞專用(yong)培養(yang)基培(pei)養篩選制備而(er)來，細(xi)胞總(zong)量約(yue)為(wei)5×10?cells/瓶。
質量檢測(ce)：

公司(si)實(shi)驗室(shi)分(fen)離(li)的(de)兔(tu)角膜內(nei)皮(pi)經(jing)NSE（神經元(yuan)特異(yi)性(xing)烯(xi)醇(chun)化酶(mei)）免(mian)疫(yi)熒光鑒(jian)定(ding)，純度可(ke)達90%以(yi)上，且(qie)不(bu)含(han)有(you)HIV-1、HBV、HCV、支原體(ti)、細菌(jun)、酵(jiao)母(mu)和(he)真(zhen)菌等。

壹、細胞培養(yang)

1取(qu)材(cai) 在(zai)無(wu)菌(jun)環境(jing)下(xia)從(cong)機體(ti)取(qu)出(chu)某種組織(zhi)細胞（視實驗(yan)目的(de)而(er)定(ding)），經過壹定(ding)的處理(li)（如(ru)消(xiao)化分(fen)散(san)細(xi)胞、分離(li)等）後接(jie)入培養器(qi)血(xue)中(zhong)，這壹過程稱(cheng)為(wei)取(qu)材(cai)。如(ru)是(shi)細胞株的(de)擴(kuo)大(da)培(pei)養(yang)則(ze)無取(qu)材(cai)這壹過程。機(ji)體(ti)取(qu)出(chu)的(de)組織(zhi)細胞的培(pei)養(yang)稱(cheng)為原代(dai)培養(yang)。2培養 將取(qu)得(de)的(de)組織(zhi)細胞接(jie)入培養瓶或培養板(ban)中(zhong)的過程稱(cheng)為(wei)培(pei)養。3凍存(cun)及(ji)復蘇(su)（可(ke)參閱(yue)後面(mian)有(you)關章(zhang)節(jie)）為(wei)了(le)保(bao)存細胞，特別(bie)是(shi)不易(yi)獲得的突(tu)變(bian)型細胞或細胞株，要將細胞凍存(cun)。凍存(cun)的(de)溫度壹般用液(ye)氮(dan)的(de)溫度－196℃，將細胞收(shou)集至凍存(cun)管(guan)中加(jia)入含保護劑（壹般為二(er)甲(jia)亞(ya)碸(feng)或甘油）的(de)培(pei)養基，以(yi)壹定(ding)的冷卻(que)速度(du)凍存(cun)，最(zui)終保(bao)存於液(ye)氮(dan)中(zhong)。在(zai)極(ji)低的溫度下(xia)，細(xi)胞保存(cun)的(de)時(shi)間幾乎是(shi)無限(xian)的(de)。復(fu)蘇(su)壹般采(cai)用快融(rong)方(fang)法，即從(cong)液(ye)氮(dan)中(zhong)取(qu)出(chu)凍存(cun)管(guan)後，立即放(fang)入37℃水中，使(shi)之(zhi)在壹分鐘(zhong)內(nei)迅速融(rong)解。然(ran)後將細胞轉(zhuan)入培養器(qi)皿(min)中進行(xing)培養。

二(er)、原代(dai)細胞分離(li)

凡是(shi)來源(yuan)於(yu)胚(pei)胎(tai)、組織(zhi)器(qi)官及外(wai)周(zhou)血(xue)，經(jing)特(te)殊(shu)分離方(fang)法制(zhi)備(bei)而(er)來的原初培養(yang)的細(xi)胞稱之(zhi)為原(yuan)代(dai)細胞。1懸浮(fu)細(xi)胞的分(fen)離(li)方(fang)法組織(zhi)材料(liao)若來自血(xue)液(ye)、羊水、胸水或腹水的懸(xuan)液(ye)材(cai)料(liao)，的方(fang)法是(shi)采(cai)用1000r/min的低速離(li)心(xin)10分(fen)鐘(zhong)。經離(li)心(xin)後由於各種細胞的比(bi)重不同可(ke)在分(fen)層(ceng)液(ye)中(zhong)形(xing)成不(bu)同(tong)層(ceng)，這樣(yang)可(ke)根(gen)據需(xu)要收(shou)獲(huo)目的(de)細(xi)胞。2實體(ti)組織(zhi)材料(liao)的分(fen)離方法對(dui)於(yu)實(shi)體組織(zhi)材料(liao)，由於細(xi)胞間結(jie)合緊密，為了(le)使(shi)組織(zhi)中的(de)細(xi)胞充分(fen)分(fen)散(san)，形(xing)成細(xi)胞懸液(ye)，可(ke)采(cai)用機械分散法（物(wu)理(li)裂(lie)解）和(he)消(xiao)化分(fen)離(li)法。

三(san)、細胞增殖檢測(ce)技(ji)術

目前(qian)主要有(you)兩種用於(yu)檢測(ce)細胞增殖能(neng)力(li)的(de)方(fang)法。壹種是(shi)直接(jie)的方(fang)法，通過直接(jie)測(ce)定(ding)進行(xing)分裂

的細胞數(shu)來評價細胞的增殖能(neng)力(li)。另(ling)壹種是(shi)間接(jie)的方(fang)法，即細胞活力(li)（cell viability）檢測(ce)方法，通過檢測(ce)樣(yang)品中(zhong)健(jian)康細(xi)胞的數(shu)目來(lai)評價細胞的增殖能(neng)力(li)。顯(xian)然(ran)，細(xi)胞活力(li)檢測(ce)法並(bing)不(bu)能(neng)最(zui)終(zhong)證(zheng)明(ming)檢測(ce)樣(yang)品中(zhong)的(de)細(xi)胞是(shi)否在增殖。如細(xi)胞在某壹培養條件下會(hui)自發啟動(dong)雕(diao)亡程序(xu)，但藥(yao)物(wu)的幹(gan)擾可(ke)抑制雕(diao)亡的(de)發生；這時(shi)若采(cai)用細胞活力(li)檢測(ce)法，顯(xian)然(ran)可(ke)以(yi)區分(fen)兩(liang)種條件下的細胞數(shu)量，但我(wo)們並(bing)不(bu)能(neng)從(cong)藥物(wu)幹(gan)擾組細胞數(shu)大(da)於(yu)對(dui)照組的事實說(shuo)明(ming)藥(yao)物可(ke)促進細(xi)胞增殖的結(jie)論(lun)。所以(yi)最直接(jie)的證(zheng)據(ju)應(ying)該(gai)采(cai)用方法壹。

取(qu)材(cai)：首(shou)先，用培(pei)養(yang)液(ye)濕(shi)潤(run)所取(qu)的(de)組織(zhi)材料(liao)，並用(yong)鋒(feng)利(li)的眼科剪去除附在(zai)其(qi)上的脂(zhi)肪(fang)和(he)結締組織(zhi)。接(jie)著用(yong)平(ping)衡(heng)液(ye)（如(ru)PBS或Hanks液(ye)）漂(piao)洗(xi)，再用眼(yan)科彎(wan)剪將組織(zhi)塊(kuai)剪成小(xiao)塊(kuai)。多次用(yong)PBS或Hanks液(ye)漂(piao)洗(xi)，直到(dao)液(ye)體(ti)清(qing)亮(liang)、無油滴(di)為(wei)止。

接(jie)種：用濕(shi)潤(run)的吸(xi)管(guan)吸取(qu)切(qie)碎的組織(zhi)塊(kuai)，輕(qing)輕(qing)吹到(dao)培(pei)養瓶(ping)皿中，並按壹定(ding)間距均(jun)勻(yun)放(fang)在培(pei)養瓶(ping)底壁上。註(zhu)意不(bu)要過多，確保(bao)組織(zhi)塊(kuai)切(qie)面(mian)貼在(zai)培養瓶底壁上(shang)。

培養：將培養(yang)瓶翻(fan)轉(zhuan)，使瓶底(di)朝(chao)上(shang)，在(zai)種植了(le)組織(zhi)塊(kuai)壹側的對(dui)側面(mian)加(jia)足培(pei)養液(ye)，避(bi)免(mian)組織(zhi)塊(kuai)與(yu)培(pei)養(yang)液(ye)接(jie)觸，然(ran)後塞(sai)緊瓶塞(sai)。將種植了(le)組織(zhi)塊(kuai)的(de)壹側朝(chao)上(shang)，靜(jing)置(zhi)於(yu)37℃培養箱中(zhong)。待(dai)組織(zhi)塊(kuai)貼(tie)壁(bi)1到(dao)3小(xiao)時(shi)後翻(fan)瓶(ping)，使(shi)貼壁(bi)的(de)組織(zhi)塊(kuai)浸(jin)沒在培(pei)養液(ye)中(zhong)，繼(ji)續(xu)靜(jing)置(zhi)。換(huan)液(ye)：每(mei)隔(ge)2到(dao)3天(tian)更換壹次培(pei)養液(ye)，或者(zhe)根(gen)據培(pei)養(yang)瓶(ping)種顏色的(de)變化確(que)定(ding)換液(ye)時(shi)間。

壹、原代(dai)細胞計數(shu)

將血(xue)球(qiu)計(ji)數(shu)板及(ji)蓋(gai)片(pian)用擦試(shi)幹(gan)凈(jing)，並將蓋(gai)片(pian)蓋(gai)在(zai)計數(shu)板上(shang)。

將細胞懸液(ye)吸(xi)出(chu)少(shao)許，滴(di)加(jia)在蓋(gai)片(pian)邊緣，使懸(xuan)液(ye)充(chong)滿蓋(gai)片(pian)和(he)計數(shu)板之(zhi)間。

靜(jing)置(zhi)3分(fen)鐘(zhong)。

鏡(jing)下觀(guan)察，計算(suan)計(ji)數(shu)板四(si)大(da)格細胞總(zong)數(shu)，壓線細(xi)胞只計左(zuo)側和(he)上方(fang)的。然(ran)後按(an)下式計(ji)算：

細胞數(shu)/ml＝4大(da)格細胞總(zong)數(shu)/ 4×10000

註意：鏡(jing)下偶見(jian)由兩個(ge)以(yi)上細(xi)胞組成的(de)細(xi)胞團，應(ying)按(an)單個(ge)細胞計算(suan)，若細胞團占(zhan)10%以(yi)上，說(shuo)明(ming)分(fen)散不好(hao)，需(xu)重新(xin)制(zhi)備(bei)細胞懸液(ye)。

二(er)、原代(dai)細胞活力(li)

將細胞懸液(ye)以(yi)0.5ml加(jia)入試管(guan)中。

加(jia)入0.5ml 0.4%臺盼(pan)蘭(lan)染液(ye)，染(ran)色2壹3分鐘(zhong)。

吸取(qu)少(shao)許懸(xuan)液(ye)塗(tu)於(yu)載(zai)玻片上，加(jia)上蓋(gai)片(pian)。

鏡(jing)下取(qu)幾個(ge)任意視野分(fen)別(bie)計死(si)細胞和(he)活細(xi)胞數(shu)，計細(xi)胞活力(li)。

死(si)細胞能(neng)被(bei)臺(tai)盼(pan)蘭(lan)染上色，鏡(jing)下可(ke)見(jian)深(shen)蘭(lan)色的(de)細胞，活細(xi)胞不被(bei)染(ran)色，鏡(jing)下呈(cheng)無色透(tou)明(ming)狀。

活力(li)測(ce)定(ding)可(ke)以(yi)和(he)細胞計數(shu)合起(qi)來(lai)進行(xing)，但要考(kao)慮(lv)到染液(ye)對(dui)原(yuan)細(xi)胞懸液(ye)的(de)加(jia)倍稀(xi)釋作(zuo)用(yong)。