【概(gai)要描(miao)述(shu)】雞肺(fei)動脈(mai)平滑肌細(xi)胞(bao)的(de)相(xiang)關產(chan)品(pin)：A549+RFP人非小(xiao)細(xi)胞(bao)人(ren)原(yuan)代(dai)胰腺腺泡(pao)上皮細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠原(yuan)代(dai)氣(qi)管(guan)上皮細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代(dai)胸主動脈(mai)平滑肌細(xi)胞(bao)綿(mian)羊原(yuan)代(dai)前脂肪(fang)細(xi)胞(bao)（尾(wei)巴來源(yuan)）小(xiao)鼠原(yuan)代(dai)牙周(zhou)膜(mo)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠原(yuan)代(dai)子宮(gong)蛻(tui)膜基質(zhi)細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代(dai)韌帶成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)大鼠原(yuan)代(dai)乳(ru)腺成纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)豬原(yuan)代(dai)脂肪(fang)幹(gan)細(xi)胞(bao)

雞(ji)肺(fei)動脈(mai)平滑肌細(xi)胞(bao)

培(pei)養(yang)基 含(han)FBS、生(sheng)長(chang)添(tian)加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換(huan)液(ye)頻率(lv) 每(mei)2-3天換(huan)液(ye)壹次(ci)

生(sheng)長(chang)特(te)性(xing) 貼(tie)壁(bi)

細(xi)胞(bao)形態 成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)樣

傳(chuan)代(dai)特性 可(ke)傳(chuan)5代(dai)左右；3代(dai)以內狀態

消(xiao)化(hua)液(ye) 0.25%yi蛋(dan)白(bai)酶

培(pei)養(yang)條(tiao)件(jian) 氣(qi)相(xiang)：空氣(qi)，95%；CO2，5%

雞(ji)肺(fei)動脈(mai)成纖(xian)維(wei)分(fen)離自肺(fei)動脈(mai)組織(zhi)；肺(fei)動脈(mai)亦稱(cheng)肺(fei)動脈(mai)幹。在(zai)呼(hu)吸(xi)空氣(qi)的(de)脊椎動物(wu)中，把(ba)靜脈(mai)血(xue)由(you)心臟導(dao)向(xiang)肺(fei)臟的(de)動脈(mai)。肺(fei)大動脈(mai)起(qi)於右心室，在主動脈(mai)之(zhi)前(qian)向左上後(hou)方(fang)斜行，在主動脈(mai)弓(gong)下(xia)方(fang)分為(wei)左(zuo)、右肺(fei)動脈(mai)，經肺(fei)門入(ru)肺(fei)。肺(fei)動脈(mai)幹位(wei)於心包(bao)內(nei)，為(wei)壹(yi)粗短的(de)動脈(mai)幹。起(qi)自右心室，在升主動脈(mai)前方(fang)向左(zuo)後(hou)上方(fang)斜行，至主動脈(mai)弓(gong)下(xia)方(fang)分為(wei)左(zuo)、右肺(fei)動脈(mai)。左肺(fei)動脈(mai)較短(duan)，在左(zuo)主支(zhi)氣(qi)管(guan)前(qian)方(fang)橫行，分二支進入(ru)左(zuo)肺(fei)上、下葉(ye)。右肺(fei)動脈(mai)較長(chang)而(er)粗，經升(sheng)主動脈(mai)和上腔靜脈(mai)後(hou)方(fang)向右橫行，至右肺(fei)門處分(fen)為(wei)三支進入(ru)右肺(fei)上、中、下葉(ye)。成纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)（Fibroblast）是(shi)疏松結(jie)締(di)組(zu)織(zhi)的(de)主要細(xi)胞(bao)成(cheng)分(fen)，由(you)胚(pei)胎時期的(de)間充(chong)質(zhi)細(xi)胞(bao)分(fen)化(hua)而(er)來；成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)較(jiao)大，輪廓(kuo)清(qing)楚，多為(wei)突起(qi)的(de)紡(fang)錘形或(huo)星形的扁(bian)平狀結(jie)構，其(qi)細(xi)胞(bao)核(he)呈(cheng)規(gui)則的(de)卵(luan)圓形，核仁大而(er)明(ming)顯。成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)功能(neng)活動旺(wang)盛(sheng)，細(xi)胞(bao)質(zhi)嗜弱(ruo)堿性(xing)，具(ju)明(ming)顯的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)合成和分泌活(huo)動，在(zai)壹定條(tiao)件(jian)下(xia)，它可(ke)以實(shi)現(xian)跟纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)的(de)互(hu)相(xiang)轉化(hua)；成纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)對(dui)不(bu)同程度(du)的(de)細(xi)胞(bao)變性(xing)、壞(huai)死(si)和組織(zhi)缺(que)損的修(xiu)復(fu)有(you)著十分(fen)重要的(de)作(zuo)用。剛(gang)分(fen)離的(de)肺(fei)動脈(mai)成纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)呈(cheng)圓(yuan)形、折(zhe)光(guang)性(xing)良好(hao)，懸(xuan)浮(fu)於培養(yang)基中(zhong)。30min細(xi)胞(bao)貼(tie)壁(bi)，其中(zhong)部分開(kai)始伸(shen)出偽(wei)足，表(biao)現(xian)為(wei)小(xiao)的突起(qi)；6h後(hou)細(xi)胞(bao)基(ji)本(ben)貼(tie)壁(bi)wan全(quan)，伸(shen)展成梭(suo)形，胞核清晰，分布較(jiao)均(jun)勻，散在生(sheng)長(chang)，不(bu)聚(ju)集(ji)成團；細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)迅(xun)速，5-7天即(ji)呈(cheng)融合狀態，細(xi)胞(bao)排(pai)列(lie)緊(jin)密，有的(de)交(jiao)叉重疊生長(chang)，平坦、胞(bao)體(ti)較(jiao)大，細(xi)胞(bao)質(zhi)透(tou)明，細(xi)胞(bao)核(he)較(jiao)大，呈橢(tuo)圓(yuan)形，顏色(se)淡(dan)。細(xi)胞(bao)融(rong)合，並(bing)彼此(ci)連(lian)接成網狀；細(xi)胞(bao)呈(cheng)突起(qi)的(de)紡(fang)錘形或(huo)星形的扁(bian)平分布。肺(fei)動脈(mai)成纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)在(zai)生(sheng)理(li)條(tiao)件(jian)下(xia)的主要功能(neng)包括(kuo)：構造(zao)和維(wei)持肺(fei)動脈(mai)的正(zheng)常(chang)形態；合成和釋放(fang)細(xi)胞(bao)外基(ji)質(zhi)；組織(zhi)損傷後(hou)及時大量聚(ju)集(ji)修復(fu)損傷組(zu)織(zhi)。
方(fang)法簡(jian)介：

公(gong)司(si)實(shi)驗(yan)室分離的(de)雞肺(fei)動脈(mai)平滑肌采用膠(jiao)原(yuan)酶(mei)消(xiao)化(hua)法結(jie)合差速貼壁(bi)法制(zhi)備而(er)來，細(xi)胞(bao)總(zong)量(liang)約為(wei)5×10?cells/瓶。
質(zhi)量檢測：

公(gong)司(si)實(shi)驗(yan)室分離的(de)雞肺(fei)動脈(mai)平滑肌經α-SMA免(mian)疫熒光(guang)鑒定，純(chun)度(du)可(ke)達(da)90%以上，且不(bu)含(han)有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原(yuan)體(ti)、細(xi)菌(jun)、酵(jiao)母和真菌(jun)等(deng)。

壹(yi)、細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)

1取(qu)材(cai) 在(zai)無菌(jun)環(huan)境(jing)下(xia)從(cong)機體(ti)取(qu)出某種(zhong)組織(zhi)細(xi)胞(bao)（視(shi)實(shi)驗(yan)目的而(er)定），經(jing)過(guo)壹定的(de)處(chu)理(li)（如消(xiao)化(hua)分散細(xi)胞(bao)、分(fen)離(li)等(deng)）後(hou)接入(ru)培(pei)養(yang)器血(xue)中，這(zhe)壹過(guo)程稱(cheng)為(wei)取(qu)材。如(ru)是(shi)細(xi)胞(bao)株(zhu)的(de)擴(kuo)大培養(yang)則無(wu)取(qu)材這(zhe)壹過(guo)程。機體(ti)取(qu)出的(de)組織細(xi)胞(bao)的(de)培(pei)養(yang)稱為(wei)原(yuan)代(dai)培養(yang)。2培養(yang) 將(jiang)取得的組織細(xi)胞(bao)接入(ru)培(pei)養(yang)瓶或(huo)培養(yang)板中(zhong)的(de)過(guo)程稱(cheng)為(wei)培(pei)養(yang)。3凍存(cun)及復(fu)蘇（可(ke)參閱(yue)後(hou)面有(you)關章節(jie)）為(wei)了(le)保存(cun)細(xi)胞(bao)，特(te)別(bie)是(shi)不(bu)易(yi)獲(huo)得的(de)突變型(xing)細(xi)胞(bao)或(huo)細(xi)胞(bao)株(zhu)，要將(jiang)細(xi)胞(bao)凍存(cun)。凍存(cun)的溫度壹(yi)般用液(ye)氮的(de)溫度－196℃，將(jiang)細(xi)胞(bao)收集(ji)至凍存(cun)管(guan)中(zhong)加(jia)入(ru)含(han)保(bao)護(hu)劑(ji)（壹(yi)般為(wei)二甲亞碸或(huo)甘油）的(de)培(pei)養(yang)基，以壹定的(de)冷(leng)卻速度凍存(cun)，最(zui)終(zhong)保(bao)存於液(ye)氮中(zhong)。在(zai)極(ji)低的溫度下(xia)，細(xi)胞(bao)保(bao)存(cun)的(de)時(shi)間(jian)幾乎是無限的。復(fu)蘇壹(yi)般采用快(kuai)融(rong)方(fang)法，即(ji)從液(ye)氮中(zhong)取(qu)出(chu)凍存(cun)管(guan)後(hou)，立即放(fang)入(ru)37℃水(shui)中，使(shi)之(zhi)在(zai)壹分鐘(zhong)內迅(xun)速融解。然(ran)後(hou)將(jiang)細(xi)胞(bao)轉(zhuan)入(ru)培(pei)養(yang)器皿(min)中(zhong)進行培養(yang)。

二、原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)分(fen)離(li)

凡(fan)是(shi)來源(yuan)於胚(pei)胎、組織(zhi)器官及外周(zhou)血(xue)，經特(te)殊分離(li)方(fang)法制(zhi)備而(er)來的(de)原(yuan)初培養(yang)的細(xi)胞(bao)稱(cheng)之(zhi)為(wei)原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)。1懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞(bao)的(de)分(fen)離(li)方(fang)法組(zu)織材料(liao)若(ruo)來自血(xue)液(ye)、羊水(shui)、胸(xiong)水或(huo)腹水(shui)的懸(xuan)液(ye)材料(liao)，的(de)方(fang)法是(shi)采用1000r/min的(de)低速離心10分(fen)鐘(zhong)。經離(li)心後(hou)由(you)於各(ge)種(zhong)細(xi)胞(bao)的(de)比(bi)重(zhong)不(bu)同可(ke)在(zai)分(fen)層液(ye)中形成不同層，這(zhe)樣可(ke)根(gen)據(ju)需要收獲(huo)目的細(xi)胞(bao)。2實(shi)體(ti)組(zu)織(zhi)材料的分離(li)方(fang)法對(dui)於實(shi)體(ti)組(zu)織(zhi)材料，由(you)於細(xi)胞(bao)間(jian)結(jie)合緊(jin)密，為(wei)了(le)使(shi)組(zu)織中的細(xi)胞(bao)充(chong)分(fen)分散，形成細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)，可(ke)采用機械(xie)分(fen)散法（物(wu)理(li)裂解(jie)）和消(xiao)化(hua)分離法。

三、細(xi)胞(bao)增(zeng)殖檢測技術(shu)

目前主要有(you)兩(liang)種(zhong)用於檢測細(xi)胞(bao)增(zeng)殖能(neng)力的方(fang)法。壹(yi)種(zhong)是直(zhi)接的方(fang)法，通(tong)過(guo)直接測定進(jin)行分裂

的(de)細(xi)胞(bao)數來評價細(xi)胞(bao)的(de)增(zeng)殖能(neng)力。另壹(yi)種(zhong)是間(jian)接的方(fang)法，即(ji)細(xi)胞(bao)活(huo)力（cell viability）檢測方(fang)法，通(tong)過(guo)檢測樣品(pin)中健康細(xi)胞(bao)的(de)數目來評價細(xi)胞(bao)的(de)增(zeng)殖能(neng)力。顯然(ran)，細(xi)胞(bao)活(huo)力檢測法並(bing)不能(neng)最(zui)終(zhong)證(zheng)明檢測樣品(pin)中的細(xi)胞(bao)是(shi)否在(zai)增殖。如(ru)細(xi)胞(bao)在(zai)某壹培(pei)養(yang)條(tiao)件(jian)下(xia)會自發(fa)啟動雕亡程(cheng)序(xu)，但藥物(wu)的(de)幹(gan)擾(rao)可(ke)抑(yi)制(zhi)雕亡的(de)發(fa)生；這(zhe)時若(ruo)采用細(xi)胞(bao)活(huo)力檢測法，顯然(ran)可(ke)以區分兩(liang)種(zhong)條(tiao)件(jian)下(xia)的細(xi)胞(bao)數量，但我(wo)們(men)並(bing)不能(neng)從藥(yao)物幹(gan)擾(rao)組細(xi)胞(bao)數大於對(dui)照(zhao)組(zu)的(de)事(shi)實(shi)說(shuo)明(ming)藥(yao)物可(ke)促(cu)進(jin)細(xi)胞(bao)增(zeng)殖的(de)結(jie)論。所(suo)以最(zui)直接的證據(ju)應(ying)該(gai)采用方(fang)法壹(yi)。

取(qu)材(cai)：首(shou)先，用培(pei)養(yang)液(ye)濕潤所(suo)取(qu)的組(zu)織(zhi)材料(liao)，並(bing)用鋒利(li)的(de)眼科剪去除附在其上的脂肪(fang)和結(jie)締(di)組(zu)織(zhi)。接著用平衡液(ye)（如PBS或(huo)Hanks液(ye)）漂(piao)洗(xi)，再用眼(yan)科(ke)彎剪(jian)將(jiang)組織塊(kuai)剪(jian)成(cheng)小(xiao)塊(kuai)。多次(ci)用PBS或(huo)Hanks液(ye)漂(piao)洗(xi)，直到(dao)液(ye)體清(qing)亮(liang)、無油滴(di)為(wei)止(zhi)。

接種(zhong)：用濕(shi)潤的(de)吸(xi)管(guan)吸(xi)取(qu)切碎(sui)的(de)組織(zhi)塊(kuai)，輕(qing)輕(qing)吹到(dao)培養(yang)瓶皿(min)中(zhong)，並(bing)按壹(yi)定間(jian)距(ju)均勻(yun)放(fang)在(zai)培(pei)養(yang)瓶底(di)壁(bi)上。註意不要過(guo)多，確(que)保組(zu)織(zhi)塊(kuai)切(qie)面貼(tie)在(zai)培(pei)養(yang)瓶底(di)壁(bi)上。

培(pei)養(yang)：將(jiang)培養(yang)瓶翻(fan)轉(zhuan)，使(shi)瓶底(di)朝(chao)上，在種(zhong)植了(le)組織(zhi)塊(kuai)壹(yi)側(ce)的(de)對(dui)側(ce)面加(jia)足培(pei)養(yang)液(ye)，避(bi)免(mian)組織(zhi)塊(kuai)與(yu)培(pei)養(yang)液(ye)接觸(chu)，然(ran)後(hou)塞(sai)緊(jin)瓶塞(sai)。將(jiang)種(zhong)植了(le)組織(zhi)塊(kuai)的(de)壹(yi)側(ce)朝(chao)上，靜置(zhi)於37℃培養(yang)箱中。待組(zu)織(zhi)塊(kuai)貼(tie)壁(bi)1到3小(xiao)時後(hou)翻(fan)瓶，使(shi)貼(tie)壁(bi)的組(zu)織(zhi)塊(kuai)浸沒(mei)在培養(yang)液(ye)中，繼(ji)續(xu)靜置(zhi)。換(huan)液(ye)：每隔2到3天更換(huan)壹(yi)次(ci)培養(yang)液(ye)，或(huo)者(zhe)根據(ju)培(pei)養(yang)瓶種(zhong)顏色(se)的(de)變化(hua)確(que)定換(huan)液(ye)時間(jian)。

壹(yi)、原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)計數

將(jiang)血(xue)球(qiu)計數板及(ji)蓋(gai)片用擦(ca)試(shi)幹凈(jing)，並(bing)將(jiang)蓋(gai)片蓋(gai)在計數板上。

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)吸(xi)出(chu)少許(xu)，滴(di)加(jia)在(zai)蓋(gai)片邊(bian)緣(yuan)，使(shi)懸(xuan)液(ye)充(chong)滿(man)蓋(gai)片和計數板之(zhi)間(jian)。

靜置(zhi)3分(fen)鐘(zhong)。

鏡(jing)下(xia)觀(guan)察，計算(suan)計數板四(si)大格細(xi)胞(bao)總(zong)數，壓線(xian)細(xi)胞(bao)只計左(zuo)側和上方(fang)的。然(ran)後(hou)按下式計算(suan)：

細(xi)胞(bao)數/ml＝4大格細(xi)胞(bao)總(zong)數/ 4×10000

註(zhu)意：鏡下(xia)偶見(jian)由(you)兩(liang)個以上細(xi)胞(bao)組(zu)成(cheng)的(de)細(xi)胞(bao)團，應(ying)按(an)單(dan)個細(xi)胞(bao)計算(suan)，若(ruo)細(xi)胞(bao)團占10%以上，說(shuo)明(ming)分(fen)散不好(hao)，需重(zhong)新(xin)制(zhi)備細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)。

二、原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)活(huo)力

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)以0.5ml加(jia)入(ru)試(shi)管(guan)中(zhong)。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺盼蘭染(ran)液(ye)，染(ran)色2壹(yi)3分(fen)鐘(zhong)。

吸(xi)取(qu)少許(xu)懸(xuan)液(ye)塗於載玻片上，加(jia)上蓋(gai)片。

鏡(jing)下(xia)取(qu)幾個任(ren)意視(shi)野(ye)分(fen)別(bie)計死(si)細(xi)胞(bao)和活細(xi)胞(bao)數，計細(xi)胞(bao)活(huo)力。

死(si)細(xi)胞(bao)能(neng)被(bei)臺盼蘭染(ran)上色，鏡下可(ke)見(jian)深(shen)蘭色的(de)細(xi)胞(bao)，活(huo)細(xi)胞(bao)不(bu)被(bei)染(ran)色，鏡(jing)下(xia)呈無色透(tou)明狀(zhuang)。

活(huo)力測定可(ke)以和細(xi)胞(bao)計數合起(qi)來進(jin)行，但要考慮到染(ran)液(ye)對(dui)原(yuan)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)的加(jia)倍(bei)稀(xi)釋作(zuo)用。