【概(gai)要(yao)描(miao)述(shu)】兔關節軟骨(gu)細胞(bao)的相(xiang)關(guan)產品(pin)：Karpas 422人(ren)非(fei)霍(huo)奇(qi)金(jin)淋巴(ba)瘤人(ren)原(yuan)代(dai)主(zhu)動脈(mai)平(ping)滑肌細胞(bao)大鼠原(yuan)代(dai)臍靜脈(mai)內(nei)皮細胞(bao)小(xiao)鼠腎臟巨噬(shi)細胞(bao)人(ren)原(yuan)代(dai)肝Kupffer細胞(bao)人(ren)原(yuan)代(dai)DC細胞(bao)大鼠原(yuan)代(dai)肺(fei)微血(xue)管內(nei)皮細胞(bao)人(ren)原(yuan)代(dai)腦(nao)膜(mo)細胞(bao)大鼠原(yuan)代(dai)心房(fang)心肌細胞(bao)小(xiao)鼠原(yuan)代(dai)胃成纖維(wei)細胞(bao)

兔關節軟骨(gu)細胞(bao)

培(pei)養(yang)基 含(han)FBS、生(sheng)長(chang)添(tian)加(jia)劑、Penicillin、Streptomycin等

換(huan)液(ye)頻率(lv) 每3-4天(tian)換(huan)液(ye)壹(yi)次(ci)

生(sheng)長(chang)特(te)性 貼(tie)壁(bi)

細胞(bao)形(xing)態(tai) 梭(suo)形(xing)、多(duo)角形(xing)

傳代(dai)特(te)性 可傳5代(dai)左(zuo)右；3代(dai)以(yi)內(nei)狀態(tai)

消化(hua)液 0.25%yi蛋(dan)白(bai)酶(mei)

培(pei)養(yang)條件 氣(qi)相(xiang)：空(kong)氣(qi)，95%；CO2，5%

兔關節軟骨(gu)分(fen)離(li)自關(guan)節軟骨(gu)組織(zhi)；關(guan)節軟骨(gu)屬(shu)於(yu)透(tou)明軟(ruan)骨(gu)，表面(mian)光滑、呈淡藍(lan)色、有光澤(ze)，它(ta)是由(you)壹(yi)種(zhong)特(te)殊(shu)的叫(jiao)做(zuo)致密結締(di)組織(zhi)的膠(jiao)原纖維(wei)構成(cheng)的基(ji)本(ben)框架(jia)，這種框(kuang)架呈半(ban)環形(xing)，類(lei)似拱(gong)形(xing)球門(men)，其(qi)底端(duan)緊緊附(fu)著(zhe)在(zai)下面(mian)的骨(gu)質(zhi)上(shang)，上(shang)端(duan)朝(chao)向(xiang)關節面(mian)，這種結(jie)構使(shi)關節軟骨(gu)緊緊與骨結合(he)起來(lai)而不(bu)會掉(diao)下來(lai)，同時當(dang)受(shou)到壓力時候(hou)，還(hai)可以(yi)有(you)少許的變(bian)形(xing)，起(qi)到緩沖(chong)壓力的作(zuo)用(yong)。在(zai)這些(xie)纖維(wei)之(zhi)間(jian)，散(san)在(zai)分(fen)布著(zhe)軟(ruan)骨細胞(bao)，軟(ruan)骨(gu)細胞(bao)由(you)淺層(ceng)向(xiang)深(shen)層(ceng)逐(zhu)漸由(you)扁平(ping)樣至(zhi)橢(tuo)圓(yuan)或(huo)圓(yuan)形(xing)的細胞(bao)組成，這些(xie)軟(ruan)骨(gu)細胞(bao)維(wei)持(chi)關節軟骨(gu)的正(zheng)常代(dai)謝(xie)。關(guan)節軟骨(gu)沒(mei)有神經(jing)支配(pei)，也(ye)沒(mei)有(you)血(xue)管，其營養(yang)成分(fen)必須從(cong)關(guan)節液中(zhong)取(qu)得，而其代謝(xie)廢(fei)物(wu)也(ye)必(bi)須排(pai)至(zhi)關(guan)節液中(zhong)，關(guan)節軟骨(gu)的這種營養(yang)代謝(xie)必(bi)須通過關節運(yun)動，使(shi)關節軟骨(gu)不(bu)斷的受(shou)到(dao)壓力刺激才(cai)行(xing)，所以(yi)關(guan)節運(yun)動對(dui)於(yu)維(wei)持(chi)關節軟骨(gu)的正(zheng)常結(jie)構起(qi)重(zhong)要(yao)的作(zuo)用(yong)。關(guan)節軟骨(gu)細胞(bao)位(wei)於(yu)關節軟骨(gu)陷窩(wo)內(nei)。幼稚的關(guan)節軟骨(gu)細胞(bao)位(wei)於(yu)關節軟骨(gu)組織(zhi)的表層，單(dan)個分(fen)布、體(ti)積(ji)較(jiao)小(xiao)、呈(cheng)橢(tuo)圓(yuan)形(xing)，長(chang)軸與(yu)關(guan)節軟骨(gu)表面(mian)平行，越向深(shen)層(ceng)的關(guan)節軟骨(gu)細胞(bao)體(ti)積(ji)之(zhi)間(jian)增(zeng)大呈圓(yuan)形(xing)，細胞(bao)核(he)圓(yuan)形(xing)或(huo)卵(luan)圓(yuan)形(xing)、染色淺，細胞(bao)質(zhi)弱(ruo)嗜(shi)堿(jian)性，常見(jian)數量(liang)不(bu)壹(yi)的脂滴(di)。成熟(shu)的關(guan)節軟骨(gu)細胞(bao)多(duo)2-8個(ge)成(cheng)群分(fen)布於(yu)關節軟骨(gu)陷窩(wo)內(nei)，這些(xie)關(guan)節軟骨(gu)細胞(bao)由(you)同(tong)壹(yi)個(ge)母細胞(bao)分(fen)裂(lie)增(zeng)殖而成，稱為(wei)同(tong)源(yuan)細胞(bao)群(qun)。電(dian)鏡(jing)下，關(guan)節軟骨(gu)細胞(bao)有(you)突(tu)起(qi)和(he)皺褶，細胞(bao)質(zhi)內(nei)有大量的粗(cu)面(mian)內(nei)質網和(he)發達(da)的高(gao)爾基復合(he)體(ti)及(ji)少量(liang)的線(xian)粒體(ti)。在(zai)組織(zhi)切(qie)片(pian)中(zhong)，關節軟骨(gu)細胞(bao)收(shou)縮(suo)為(wei)不(bu)規則形(xing)，在(zai)軟骨囊和(he)細胞(bao)之(zhi)間(jian)出(chu)現(xian)較(jiao)大的腔(qiang)隙(xi)。體(ti)外(wai)培(pei)養(yang)的關(guan)節軟骨(gu)細胞(bao)對(dui)於(yu)研(yan)究(jiu)其生(sheng)理(li)功能、藥物(wu)作(zuo)用(yong)以(yi)及(ji)各種(zhong)致病因(yin)素作(zuo)用(yong)下的病(bing)理(li)生(sheng)理(li)改變(bian)具重(zhong)要(yao)意義(yi)。
方法(fa)簡介(jie)：

公(gong)司(si)實驗室分(fen)離(li)的兔關節軟骨(gu)采(cai)用膠(jiao)原酶(mei)聯(lian)合(he)中性dan白(bai)酶(mei)消化(hua)制備(bei)而來(lai)，細胞(bao)總(zong)量(liang)約(yue)為(wei)5×10?cells/瓶。
質(zhi)量(liang)檢(jian)測：

公(gong)司(si)實驗室分(fen)離(li)的兔關節軟骨(gu)經(jing)Ⅱ型膠(jiao)原蛋(dan)白(bai)免(mian)疫熒光鑒(jian)定，純(chun)度可達(da)90%以(yi)上(shang)，且不(bu)含(han)有HIV-1、HBV、HCV、支原(yuan)體(ti)、細菌(jun)、酵(jiao)母和真(zhen)菌(jun)等(deng)。

壹(yi)、細胞(bao)培(pei)養(yang)

1取(qu)材(cai) 在無菌(jun)環境下從(cong)機(ji)體(ti)取(qu)出(chu)某種組織(zhi)細胞(bao)（視(shi)實(shi)驗目(mu)的而定），經過壹(yi)定的處理(li)（如消化(hua)分(fen)散細胞(bao)、分(fen)離(li)等）後(hou)接(jie)入培養(yang)器(qi)血(xue)中(zhong)，這壹(yi)過程稱為(wei)取(qu)材(cai)。如是細胞(bao)株(zhu)的擴(kuo)大培養(yang)則無取材這壹(yi)過程。機(ji)體(ti)取(qu)出(chu)的組織(zhi)細胞(bao)的培(pei)養(yang)稱為(wei)原(yuan)代(dai)培養(yang)。2培養(yang) 將取得(de)的組織(zhi)細胞(bao)接(jie)入培養(yang)瓶或(huo)培(pei)養(yang)板中的過程稱為(wei)培(pei)養(yang)。3凍存及(ji)復蘇（可參閱後面(mian)有關章節）為了(le)保(bao)存細胞(bao)，特(te)別是不(bu)易獲(huo)得(de)的突(tu)變(bian)型細胞(bao)或(huo)細胞(bao)株(zhu)，要將細胞(bao)凍存。凍存的溫(wen)度(du)壹(yi)般(ban)用液氮(dan)的溫(wen)度(du)－196℃，將細胞(bao)收(shou)集至凍存管中加入含(han)保護(hu)劑（壹(yi)般(ban)為二(er)甲(jia)亞(ya)碸或(huo)甘油(you)）的培(pei)養(yang)基，以(yi)壹(yi)定的冷(leng)卻速(su)度凍存，最(zui)終(zhong)保存於(yu)液氮(dan)中(zhong)。在(zai)極低的溫(wen)度(du)下，細胞(bao)保(bao)存的時間(jian)幾(ji)乎(hu)是無(wu)限(xian)的。復蘇壹(yi)般(ban)采(cai)用快(kuai)融(rong)方法(fa)，即(ji)從(cong)液(ye)氮(dan)中(zhong)取(qu)出凍存管後，立即放(fang)入37℃水(shui)中(zhong)，使(shi)之在(zai)壹(yi)分(fen)鐘(zhong)內(nei)迅速融(rong)解(jie)。然(ran)後(hou)將(jiang)細胞(bao)轉入培養(yang)器(qi)皿(min)中(zhong)進(jin)行培(pei)養(yang)。

二(er)、原代(dai)細胞(bao)分(fen)離(li)

凡(fan)是(shi)來(lai)源於(yu)胚胎(tai)、組織(zhi)器(qi)官及(ji)外周(zhou)血，經(jing)特(te)殊(shu)分(fen)離(li)方法(fa)制(zhi)備(bei)而來(lai)的原(yuan)初培(pei)養(yang)的細胞(bao)稱之(zhi)為(wei)原(yuan)代細胞(bao)。1懸(xuan)浮(fu)細胞(bao)的分(fen)離(li)方法(fa)組織(zhi)材(cai)料(liao)若(ruo)來(lai)自血(xue)液(ye)、羊水(shui)、胸(xiong)水(shui)或(huo)腹水(shui)的懸(xuan)液(ye)材料(liao)，的方法(fa)是(shi)采(cai)用1000r/min的低速離(li)心10分(fen)鐘(zhong)。經(jing)離(li)心後(hou)由(you)於(yu)各種(zhong)細胞(bao)的比(bi)重(zhong)不(bu)同可在分(fen)層液中形(xing)成(cheng)不(bu)同層(ceng)，這樣可根據(ju)需(xu)要收(shou)獲(huo)目(mu)的細胞(bao)。2實(shi)體(ti)組織(zhi)材(cai)料(liao)的分(fen)離(li)方法(fa)對(dui)於(yu)實體(ti)組織(zhi)材(cai)料(liao)，由(you)於(yu)細胞(bao)間(jian)結(jie)合(he)緊密，為了(le)使(shi)組織(zhi)中(zhong)的細胞(bao)充分(fen)分(fen)散，形(xing)成(cheng)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)，可采(cai)用機(ji)械(xie)分(fen)散法(fa)（物(wu)理(li)裂(lie)解(jie)）和消化(hua)分(fen)離(li)法(fa)。

三、細胞(bao)增(zeng)殖檢(jian)測技術

目(mu)前(qian)主(zhu)要有(you)兩種用(yong)於(yu)檢(jian)測細胞(bao)增(zeng)殖能力的方法(fa)。壹(yi)種(zhong)是直(zhi)接的方法(fa)，通過直(zhi)接測定進(jin)行分(fen)裂(lie)

的細胞(bao)數(shu)來(lai)評(ping)價細胞(bao)的增(zeng)殖能力。另壹(yi)種(zhong)是間(jian)接(jie)的方法(fa)，即(ji)細胞(bao)活(huo)力(li)（cell viability）檢(jian)測方法(fa)，通過檢(jian)測樣品(pin)中(zhong)健康(kang)細胞(bao)的數(shu)目(mu)來(lai)評(ping)價細胞(bao)的增(zeng)殖能力。顯然(ran)，細胞(bao)活(huo)力(li)檢(jian)測法(fa)並(bing)不(bu)能最(zui)終(zhong)證(zheng)明檢(jian)測樣品(pin)中(zhong)的細胞(bao)是(shi)否在(zai)增(zeng)殖。如細胞(bao)在(zai)某壹(yi)培(pei)養(yang)條件下會(hui)自(zi)發啟(qi)動(dong)雕亡(wang)程序，但(dan)藥物(wu)的幹(gan)擾可抑制(zhi)雕(diao)亡(wang)的發生(sheng)；這時若采(cai)用細胞(bao)活(huo)力(li)檢(jian)測法(fa)，顯然(ran)可以(yi)區分(fen)兩種條(tiao)件(jian)下的細胞(bao)數(shu)量(liang)，但(dan)我們並(bing)不(bu)能從(cong)藥物(wu)幹(gan)擾組細胞(bao)數(shu)大於(yu)對(dui)照組的事(shi)實(shi)說明藥物(wu)可促進(jin)細胞(bao)增(zeng)殖的結(jie)論(lun)。所以(yi)最(zui)直(zhi)接的證(zheng)據(ju)應該(gai)采(cai)用方法(fa)壹(yi)。

取(qu)材(cai)：首(shou)先，用(yong)培養(yang)液濕潤(run)所取的組織(zhi)材(cai)料(liao)，並(bing)用(yong)鋒(feng)利的眼(yan)科剪去除(chu)附(fu)在其(qi)上(shang)的脂肪和(he)結(jie)締(di)組織(zhi)。接(jie)著(zhe)用(yong)平衡(heng)液（如(ru)PBS或(huo)Hanks液(ye)）漂洗，再(zai)用眼(yan)科彎(wan)剪將組織(zhi)塊(kuai)剪成小(xiao)塊。多次(ci)用(yong)PBS或(huo)Hanks液(ye)漂洗，直(zhi)到液體(ti)清(qing)亮、無(wu)油(you)滴(di)為止。

接(jie)種(zhong)：用濕潤(run)的吸(xi)管吸(xi)取(qu)切(qie)碎的組織(zhi)塊(kuai)，輕輕吹(chui)到(dao)培(pei)養(yang)瓶皿(min)中(zhong)，並(bing)按壹(yi)定間(jian)距(ju)均勻(yun)放(fang)在(zai)培(pei)養(yang)瓶底(di)壁上(shang)。註(zhu)意不(bu)要過多，確保組織(zhi)塊(kuai)切(qie)面(mian)貼在培(pei)養(yang)瓶底(di)壁上(shang)。

培(pei)養(yang)：將培養(yang)瓶翻(fan)轉，使(shi)瓶底(di)朝上(shang)，在(zai)種(zhong)植(zhi)了(le)組織(zhi)塊(kuai)壹(yi)側(ce)的對(dui)側(ce)面(mian)加足培(pei)養(yang)液，避免(mian)組織(zhi)塊(kuai)與(yu)培(pei)養(yang)液接觸(chu)，然(ran)後(hou)塞(sai)緊瓶塞(sai)。將種(zhong)植(zhi)了(le)組織(zhi)塊(kuai)的壹(yi)側(ce)朝上(shang)，靜置(zhi)於(yu)37℃培養(yang)箱中。待組織(zhi)塊(kuai)貼(tie)壁(bi)1到3小時後翻(fan)瓶，使(shi)貼壁(bi)的組織(zhi)塊(kuai)浸(jin)沒在(zai)培養(yang)液中，繼(ji)續靜置(zhi)。換(huan)液(ye)：每隔2到3天(tian)更換(huan)壹(yi)次(ci)培(pei)養(yang)液，或(huo)者(zhe)根(gen)據(ju)培(pei)養(yang)瓶種(zhong)顏色的變(bian)化(hua)確定換(huan)液(ye)時間(jian)。

壹(yi)、原(yuan)代細胞(bao)計數

將(jiang)血(xue)球計數板(ban)及(ji)蓋(gai)片(pian)用擦(ca)試幹凈，並(bing)將(jiang)蓋(gai)片(pian)蓋(gai)在(zai)計數板(ban)上(shang)。

將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)吸(xi)出(chu)少(shao)許，滴(di)加在蓋(gai)片(pian)邊緣，使(shi)懸液(ye)充滿蓋(gai)片(pian)和計數板(ban)之(zhi)間(jian)。

靜置(zhi)3分(fen)鐘(zhong)。

鏡(jing)下觀察(cha)，計算(suan)計數板(ban)四(si)大格細胞(bao)總(zong)數(shu)，壓線(xian)細胞(bao)只(zhi)計左(zuo)側(ce)和(he)上(shang)方的。然(ran)後(hou)按下式(shi)計算(suan)：

細胞(bao)數(shu)/ml＝4大格細胞(bao)總(zong)數(shu)/ 4×10000

註(zhu)意：鏡(jing)下偶(ou)見(jian)由兩個以(yi)上(shang)細胞(bao)組成的細胞(bao)團(tuan)，應按單個(ge)細胞(bao)計算(suan)，若細胞(bao)團(tuan)占(zhan)10%以(yi)上(shang)，說(shuo)明分(fen)散不(bu)好，需(xu)重(zhong)新(xin)制(zhi)備(bei)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)。

二(er)、原代(dai)細胞(bao)活(huo)力(li)

將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)以(yi)0.5ml加(jia)入試管中。

加(jia)入0.5ml 0.4%臺盼蘭(lan)染液，染色2壹(yi)3分(fen)鐘(zhong)。

吸(xi)取(qu)少(shao)許懸液(ye)塗於(yu)載玻(bo)片上(shang)，加(jia)上(shang)蓋(gai)片(pian)。

鏡(jing)下取(qu)幾(ji)個(ge)任意視(shi)野(ye)分(fen)別計死(si)細胞(bao)和(he)活(huo)細胞(bao)數(shu)，計細胞(bao)活(huo)力(li)。

死(si)細胞(bao)能被臺盼蘭(lan)染上(shang)色(se)，鏡(jing)下可見(jian)深(shen)蘭(lan)色的細胞(bao)，活(huo)細胞(bao)不(bu)被染色，鏡(jing)下呈(cheng)無(wu)色(se)透(tou)明狀。

活(huo)力(li)測定可以(yi)和(he)細胞(bao)計數合(he)起來(lai)進(jin)行，但(dan)要考慮(lv)到(dao)染液對(dui)原(yuan)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)的加(jia)倍(bei)稀釋(shi)作(zuo)用(yong)。