【概(gai)要描述(shu)】雞肺(fei)動脈內皮細胞的(de)相(xiang)關(guan)產品(pin)：NCI-H1734 (STR)人(ren)非小細胞(bao)綿羊原代(dai)前(qian)脂(zhi)肪細胞（皮(pi)下(xia)來(lai)源）大鼠(shu)原代(dai)精(jing)原細(xi)胞(bao)豬(zhu)原代(dai)胃成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞人原代(dai)食管纖(xian)維(wei)瘤(liu)細胞小鼠(shu)原代(dai)破(po)骨細胞兔原代(dai)肺(fei)微(wei)血(xue)管(guan)內皮細胞兔(tu)原代(dai)皮(pi)膚(fu)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞兔原代(dai)腎動脈內皮細胞人(ren)原代(dai)腦(nao)動脈內皮細胞

雞肺(fei)動脈內皮細胞

包被條(tiao)件(jian) PLL（0.1mg/ml），明膠(jiao)（0.1%）

培養(yang)基(ji) 含FBS、生長添加(jia)劑、Penicillin、Streptomycin等

換液(ye)頻(pin)率 每(mei)2-3天換液(ye)壹次

生長特(te)性 貼(tie)壁(bi)

細胞形(xing)態(tai) 內皮細胞樣

傳代(dai)特(te)性 可傳2-3代(dai)

消(xiao)化(hua)液(ye) 0.25%yi蛋(dan)白(bai)酶(mei)

培養(yang)條(tiao)件(jian) 氣相(xiang)：空氣，95%；CO2，5%

雞肺(fei)大(da)動脈內皮分離自(zi)肺(fei)大(da)動脈組(zu)織(zhi)；肺(fei)大(da)動脈亦稱肺(fei)動脈幹(gan)。在(zai)呼(hu)吸(xi)空氣的(de)脊(ji)椎(zhui)動物中(zhong)，把靜(jing)脈血(xue)由(you)心(xin)臟(zang)導(dao)向(xiang)肺(fei)臟(zang)的(de)動脈。肺(fei)大(da)動脈起(qi)於(yu)右(you)心(xin)室(shi)，在(zai)主動脈之前(qian)向(xiang)左上(shang)後方斜(xie)行(xing)。細胞(bao)呈(cheng)單層(ceng)多(duo)角(jiao)形(xing)鋪路石狀分布；該(gai)細胞(bao)在維(wei)持(chi)血(xue)管(guan)內外(wai)的(de)動態平衡(heng)、合成(cheng)和分泌細胞因(yin)子和介(jie)質(zhi)、維(wei)持(chi)凝(ning)血(xue)和纖(xian)溶的(de)動態平衡(heng)中(zhong)起(qi)重要(yao)作用。肺(fei)大(da)動脈內皮細胞呈(cheng)單層(ceng)多(duo)角(jiao)形(xing)鋪路石狀分布，該(gai)細胞(bao)在維(wei)持(chi)血(xue)管(guan)內外(wai)的(de)動態平衡(heng)、合成(cheng)和分泌細胞因(yin)子和介(jie)質(zhi)、維(wei)持(chi)凝(ning)血(xue)和纖(xian)溶的(de)動態平衡(heng)中(zhong)起(qi)重要(yao)作用。
方法(fa)簡介：

公(gong)司實驗室(shi)分離的(de)雞肺(fei)大(da)動脈內皮采用yi蛋(dan)白(bai)酶(mei)-膠(jiao)原酶(mei)聯(lian)合消(xiao)化(hua)法(fa)結合(he)差速(su)貼(tie)壁(bi)法(fa)、並通(tong)過(guo)內皮細胞專(zhuan)用培養(yang)基(ji)培養(yang)篩(shai)選(xuan)制備而(er)來，細(xi)胞(bao)總量(liang)約(yue)為(wei)5×10?cells/瓶(ping)。
質(zhi)量(liang)檢(jian)測：

公(gong)司實驗室(shi)分離的(de)雞肺(fei)動脈內皮經(jing)CD31免疫(yi)熒(ying)光(guang)鑒(jian)定(ding)，純(chun)度可(ke)達90%以(yi)上(shang)，且不含(han)有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原體(ti)、細(xi)菌(jun)、酵(jiao)母和真(zhen)菌(jun)等。

壹、細胞(bao)培養(yang)

1取材(cai) 在無(wu)菌(jun)環境下從(cong)機體(ti)取出(chu)某種組(zu)織(zhi)細胞(bao)（視(shi)實驗(yan)目的而定(ding)），經(jing)過(guo)壹定(ding)的(de)處理（如消(xiao)化(hua)分散細(xi)胞(bao)、分離等）後接入培養(yang)器(qi)血(xue)中(zhong)，這壹過(guo)程(cheng)稱為(wei)取材(cai)。如是細(xi)胞(bao)株(zhu)的擴大培養(yang)則(ze)無(wu)取(qu)材(cai)這壹過(guo)程(cheng)。機體(ti)取出(chu)的組(zu)織(zhi)細胞(bao)的(de)培養(yang)稱為(wei)原代(dai)培養(yang)。2培養(yang) 將取(qu)得的(de)組(zu)織(zhi)細胞(bao)接(jie)入培養(yang)瓶(ping)或培養(yang)板(ban)中(zhong)的過(guo)程(cheng)稱為(wei)培養(yang)。3凍存(cun)及復(fu)蘇（可參(can)閱後面(mian)有(you)關(guan)章節）為(wei)了保存(cun)細胞(bao)，特(te)別是不(bu)易(yi)獲得的(de)突變(bian)型細胞或細(xi)胞株(zhu)，要將細(xi)胞凍存(cun)。凍存(cun)的溫(wen)度壹般用液(ye)氮的(de)溫度(du)－196℃，將細(xi)胞收(shou)集至凍存(cun)管中(zhong)加(jia)入含保護劑（壹般為(wei)二甲(jia)亞碸(feng)或甘(gan)油）的培養(yang)基(ji)，以壹定(ding)的(de)冷卻速(su)度(du)凍存(cun)，最終保存(cun)於(yu)液(ye)氮中(zhong)。在極(ji)低(di)的(de)溫(wen)度(du)下，細胞保存(cun)的時(shi)間幾(ji)乎是無(wu)限(xian)的(de)。復(fu)蘇壹般采(cai)用快融(rong)方法(fa)，即從(cong)液(ye)氮中(zhong)取出(chu)凍存(cun)管後，立(li)即放(fang)入37℃水(shui)中(zhong)，使之(zhi)在(zai)壹分鐘(zhong)內迅(xun)速(su)融(rong)解(jie)。然(ran)後將細(xi)胞轉(zhuan)入培養(yang)器(qi)皿(min)中(zhong)進行(xing)培養(yang)。

二、原代(dai)細(xi)胞(bao)分離

凡是來(lai)源於(yu)胚(pei)胎、組(zu)織(zhi)器(qi)官(guan)及外(wai)周(zhou)血(xue)，經(jing)特(te)殊分離方法(fa)制備而(er)來的(de)原初(chu)培養(yang)的(de)細胞(bao)稱之(zhi)為原代(dai)細(xi)胞(bao)。1懸(xuan)浮細(xi)胞(bao)的(de)分離方法(fa)組(zu)織(zhi)材(cai)料若(ruo)來自(zi)血(xue)液(ye)、羊水(shui)、胸(xiong)水(shui)或腹(fu)水(shui)的(de)懸(xuan)液(ye)材(cai)料，的(de)方法(fa)是采(cai)用1000r/min的低(di)速(su)離心(xin)10分鐘(zhong)。經(jing)離心(xin)後由(you)於(yu)各(ge)種(zhong)細(xi)胞的比重不(bu)同可在分層(ceng)液(ye)中(zhong)形成(cheng)不(bu)同層(ceng)，這樣可根(gen)據(ju)需(xu)要(yao)收獲目的細胞(bao)。2實體組(zu)織(zhi)材(cai)料的(de)分離方法(fa)對於(yu)實(shi)體(ti)組(zu)織(zhi)材(cai)料，由(you)於(yu)細(xi)胞(bao)間(jian)結合緊密(mi)，為(wei)了使組(zu)織(zhi)中(zhong)的細(xi)胞充(chong)分分散，形(xing)成(cheng)細(xi)胞懸(xuan)液(ye)，可采(cai)用機械(xie)分散法(fa)（物理裂(lie)解(jie)）和消(xiao)化(hua)分離法(fa)。

三(san)、細胞(bao)增殖檢(jian)測技(ji)術(shu)

目前(qian)主(zhu)要有兩種(zhong)用於(yu)檢(jian)測(ce)細(xi)胞增殖能(neng)力的方法(fa)。壹種是直(zhi)接(jie)的(de)方法(fa)，通(tong)過(guo)直(zhi)接(jie)測(ce)定(ding)進行(xing)分裂(lie)

的細胞(bao)數(shu)來評(ping)價(jia)細胞的(de)增殖能(neng)力。另(ling)壹種是間(jian)接(jie)的(de)方法(fa)，即細胞活(huo)力（cell viability）檢測(ce)方法(fa)，通(tong)過(guo)檢(jian)測(ce)樣品(pin)中(zhong)健(jian)康細(xi)胞(bao)的數(shu)目來評(ping)價(jia)細胞的(de)增殖能(neng)力。顯然(ran)，細胞(bao)活力檢測(ce)法(fa)並不(bu)能(neng)最終證(zheng)明檢(jian)測(ce)樣品(pin)中(zhong)的細(xi)胞是否(fou)在(zai)增殖。如細胞(bao)在(zai)某壹培養(yang)條(tiao)件(jian)下會自(zi)發啟(qi)動雕亡程(cheng)序(xu)，但藥物的(de)幹(gan)擾(rao)可抑(yi)制雕亡的發生(sheng)；這時(shi)若采(cai)用細胞活(huo)力檢測(ce)法(fa)，顯然(ran)可以(yi)區分兩種(zhong)條件(jian)下的(de)細胞(bao)數(shu)量(liang)，但我們並不(bu)能(neng)從(cong)藥(yao)物幹(gan)擾(rao)組(zu)細(xi)胞(bao)數(shu)大於(yu)對(dui)照組(zu)的(de)事(shi)實(shi)說(shuo)明(ming)藥物可(ke)促(cu)進細胞(bao)增殖的(de)結論(lun)。所以最直接(jie)的(de)證(zheng)據應(ying)該(gai)采用方法(fa)壹。

取材(cai)：首(shou)先，用培養(yang)液(ye)濕潤(run)所取的(de)組(zu)織(zhi)材(cai)料，並(bing)用鋒利(li)的眼科(ke)剪去(qu)除(chu)附(fu)在其(qi)上(shang)的脂肪和結(jie)締組(zu)織(zhi)。接著用平衡(heng)液(ye)（如PBS或Hanks液(ye)）漂洗(xi)，再(zai)用眼科(ke)彎剪將組(zu)織(zhi)塊剪成(cheng)小(xiao)塊。多(duo)次用PBS或Hanks液(ye)漂洗(xi)，直到(dao)液(ye)體清亮(liang)、無(wu)油滴(di)為(wei)止。

接種：用濕潤(run)的吸(xi)管吸(xi)取切(qie)碎的組(zu)織(zhi)塊，輕(qing)輕(qing)吹(chui)到培養(yang)瓶(ping)皿(min)中(zhong)，並按(an)壹定(ding)間(jian)距(ju)均(jun)勻(yun)放(fang)在(zai)培養(yang)瓶(ping)底壁(bi)上(shang)。註意(yi)不(bu)要(yao)過(guo)多(duo)，確(que)保組(zu)織(zhi)塊切(qie)面(mian)貼(tie)在(zai)培養(yang)瓶(ping)底壁(bi)上(shang)。

培養(yang)：將培養(yang)瓶(ping)翻(fan)轉(zhuan)，使瓶(ping)底朝上(shang)，在種植了組(zu)織(zhi)塊壹側的(de)對(dui)側面(mian)加(jia)足(zu)培養(yang)液(ye)，避免(mian)組(zu)織(zhi)塊與培養(yang)液(ye)接觸(chu)，然(ran)後塞緊瓶(ping)塞。將種(zhong)植了(le)組(zu)織(zhi)塊的(de)壹側朝(chao)上(shang)，靜(jing)置於(yu)37℃培養(yang)箱(xiang)中(zhong)。待組(zu)織(zhi)塊貼(tie)壁(bi)1到3小(xiao)時(shi)後翻(fan)瓶(ping)，使貼(tie)壁(bi)的組(zu)織(zhi)塊浸(jin)沒(mei)在培養(yang)液(ye)中(zhong)，繼續(xu)靜(jing)置。換液(ye)：每(mei)隔2到(dao)3天更(geng)換壹次培養(yang)液(ye)，或者(zhe)根(gen)據(ju)培養(yang)瓶(ping)種顏色的變(bian)化(hua)確(que)定(ding)換液(ye)時(shi)間。

壹、原代(dai)細(xi)胞(bao)計數(shu)

將血(xue)球(qiu)計數(shu)板(ban)及蓋片用擦試(shi)幹(gan)凈(jing)，並(bing)將蓋片蓋在計數(shu)板(ban)上(shang)。

將細(xi)胞懸(xuan)液(ye)吸(xi)出少(shao)許(xu)，滴(di)加(jia)在(zai)蓋片邊(bian)緣，使懸(xuan)液(ye)充滿(man)蓋片和計數(shu)板(ban)之(zhi)間。

靜(jing)置3分鐘(zhong)。

鏡下觀(guan)察，計算計數(shu)板(ban)四(si)大格(ge)細(xi)胞(bao)總數(shu)，壓線細(xi)胞(bao)只(zhi)計左側(ce)和上(shang)方的(de)。然(ran)後按(an)下(xia)式(shi)計算：

細胞數(shu)/ml＝4大格(ge)細(xi)胞(bao)總數(shu)/ 4×10000

註意(yi)：鏡下偶見(jian)由(you)兩個(ge)以(yi)上(shang)細胞組(zu)成(cheng)的(de)細胞團(tuan)，應按(an)單個(ge)細(xi)胞計算，若細胞(bao)團(tuan)占(zhan)10%以上(shang)，說明分散不(bu)好，需(xu)重新(xin)制備細(xi)胞懸(xuan)液(ye)。

二、原代(dai)細(xi)胞(bao)活(huo)力

將細(xi)胞懸(xuan)液(ye)以0.5ml加(jia)入試(shi)管中(zhong)。

加(jia)入0.5ml 0.4%臺盼(pan)蘭(lan)染液(ye)，染色2壹3分鐘(zhong)。

吸(xi)取少(shao)許(xu)懸(xuan)液(ye)塗於(yu)載(zai)玻(bo)片(pian)上(shang)，加(jia)上(shang)蓋片。

鏡下取(qu)幾(ji)個(ge)任(ren)意(yi)視(shi)野分別計死細胞和活(huo)細胞(bao)數(shu)，計細胞活力。

死細胞(bao)能(neng)被(bei)臺盼(pan)蘭(lan)染上(shang)色，鏡下可(ke)見(jian)深(shen)蘭(lan)色(se)的(de)細(xi)胞(bao)，活細胞不(bu)被染色，鏡下呈(cheng)無(wu)色(se)透(tou)明狀(zhuang)。

活力測定(ding)可(ke)以和細(xi)胞計數(shu)合起(qi)來進行(xing)，但要考慮(lv)到染液(ye)對原細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)的加(jia)倍(bei)稀(xi)釋(shi)作用。