【概要(yao)描述(shu)】小(xiao)鼠胚(pei)胎幹細胞公(gong)司正(zheng)在(zai)出(chu)售的產(chan)品：GBC-SD+LUC人膽(dan)囊(nang)癌細(xi)胞(bao)Spc-a-1肺(fei)腺(xian)癌細(xi)胞(bao)LTEP-a-2肺(fei)腺(xian)癌細(xi)胞(bao)QG-56人肺(fei)扁平(ping)上皮(pi)癌細(xi)胞(bao)95-C低轉移(yi)肺(fei)癌細(xi)胞(bao)LLC/GFP小(xiao)鼠肺(fei)癌細(xi)胞(bao)帶綠(lv)色(se)熒光(guang)LLC/RFP小(xiao)鼠肺(fei)癌細(xi)胞(bao)帶紅(hong)色熒光(guang)LLC-PK1MEM+10%FBSMCA-RH7777鼠肝癌細(xi)胞(bao)GIST人胃(wei)腸(chang)間(jian)質(zhi)瘤(liu)細胞

本(ben)公(gong)司所有(you)產(chan)品僅供科學實驗，不(bu)做其(qi)他科(ke)學實驗外的使(shi)用(yong)！

小(xiao)鼠胚(pei)胎幹分離自囊胚(pei)胚胎組織；胚胎幹細胞（Embryonic stem cell，ESCs，簡稱ES、EK或(huo)ESC細胞(bao)）是(shi)早(zao)期(qi)胚(pei)胎（原腸(chang)胚(pei)期(qi)之(zhi)前(qian)）或(huo)原始(shi)性(xing)腺(xian)中(zhong)分(fen)離(li)出(chu)來的壹(yi)類(lei)細(xi)胞，它(ta)具(ju)有(you)體(ti)外(wai)培(pei)養(yang)無(wu)限(xian)增(zeng)殖、自我(wo)更新(xin)和(he)多(duo)向分化(hua)的特(te)性(xing)。無(wu)論(lun)在(zai)體(ti)外(wai)還(hai)是(shi)體(ti)內(nei)環(huan)境(jing)，ES細胞(bao)都(dou)能被誘導分化(hua)為(wei)機(ji)體(ti)幾(ji)乎所有(you)的細(xi)胞(bao)類(lei)型(xing)。進壹(yi)步說(shuo)，胚(pei)胎幹細胞（ES細(xi)胞(bao)）是(shi)壹(yi)種高度(du)未分(fen)化細(xi)胞。它(ta)具(ju)有(you)發(fa)育(yu)的全(quan)能性，能分化出(chu)成體(ti)動(dong)物(wu)的所(suo)有(you)組(zu)織(zhi)和(he)器官(guan)，包(bao)括(kuo)生(sheng)殖(zhi)細胞(bao)。ES細胞(bao)具(ju)有(you)與早(zao)期(qi)胚(pei)胎細胞相似(si)的形(xing)態(tai)結(jie)構，細胞(bao)核(he)大(da)，有(you)壹(yi)個或(huo)幾(ji)個核(he)仁，胞核(he)中(zhong)多(duo)為(wei)常染(ran)色質(zhi)，胞質(zhi)胞漿(jiang)少(shao)，結(jie)構簡單。體(ti)外(wai)培(pei)養(yang)時，細胞(bao)排列(lie)緊(jin)密(mi)，呈集(ji)落狀生長。用(yong)堿性(xing)磷(lin)酸(suan)酶染(ran)色，ES細(xi)胞(bao)呈(cheng)棕(zong)紅(hong)色，而周(zhou)圍(wei)的成(cheng)纖(xian)維細(xi)胞(bao)呈(cheng)淡(dan)黃(huang)色(se)。細胞克隆(long)和(he)周圍(wei)存(cun)在(zai)明顯界(jie)限(xian)，形(xing)成的克隆(long)細(xi)胞彼(bi)此界(jie)限(xian)不(bu)清，細(xi)胞表(biao)面(mian)有(you)折(zhe)光(guang)較強(qiang)的脂狀小(xiao)滴(di)。細(xi)胞(bao)克隆(long)形(xing)態多(duo)樣，多(duo)數呈(cheng)島(dao)狀或巢狀。小(xiao)鼠ES細(xi)胞的直徑(jing)7 微(wei)米(mi)～18 微(wei)米(mi)，豬(zhu)、牛、羊ES細(xi)胞(bao)的顏色(se)較深(shen)，直徑(jing)12 微(wei)米(mi)～18 微(wei)米(mi)。胚(pei)胎幹細胞與普(pu)通細(xi)胞有(you)顯著差別(bie)，有(you)其(qi)特(te)定的生(sheng)長特(te)性(xing)和(he)特(te)定的標誌，例如堿性(xing)磷酸(suan)酶活(huo)性非常高，帶有(you)胚(pei)胎階(jie)段(duan)特(te)異性(xing)表(biao)面(mian)抗原（ Stage- specific embryonic antigens,SSEA），人類(lei)胚(pei)胎幹細胞還(hai)帶有(you)高分子(zi)量(liang)的糖(tang)蛋白TRA1-60、TRA-1-81等(deng)標誌，這些(xie)特(te)性(xing)和(he)標誌均(jun)可(ke)以(yi)用(yong)於對胚胎幹細胞進(jin)行(xing)鑒(jian)定，除(chu)此之(zhi)外，胚(pei)胎幹細胞還(hai)可(ke)以(yi)在(zai)體(ti)外(wai)傳(chuan)代(dai)，並(bing)保持正(zheng)常核(he)型。在(zai)體(ti)外(wai)培(pei)養(yang)體(ti)系(xi)中(zhong)加(jia)入(ru)分(fen)化抑(yi)制劑如白血(xue)病抑(yi)制因(yin)子(zi)（ Leukaemia inhibitory factor,LF）或(huo)者(zhe)在(zai)小(xiao)鼠胚(pei)胎成纖維細(xi)胞(bao)飼養(yang)層（MEF）上培養(yang)時，胚胎幹細胞都(dou)能呈克隆(long)性(xing)增殖，長期(qi)保(bao)持核(he)型正(zheng)常和(he)穩定，凍存(cun)解(jie)凍也(ye)不(bu)影響(xiang)不(bu)分化(hua)的特(te)性(xing)。另外(wai)，胚胎幹細胞還(hai)表(biao)現(xian)岀高水平(ping)端粒酶活(huo)性，目前(qian)證(zheng)明端(duan)粒酶與細(xi)胞衰(shuai)老密(mi)切相(xiang)關(guan)，多(duo)數成(cheng)熟細胞的端(duan)粒酶活(huo)性都很低。這些(xie)都是(shi)胚(pei)胎幹細胞與成(cheng)熟細胞不(bu)同的重(zhong)要特(te)點(dian)，也(ye)可(ke)能是(shi)其(qi)復(fu)制生(sheng)命(ming)期(qi)限(xian)遠(yuan)比體(ti)細(xi)胞(bao)長的原因。
方(fang)法(fa)簡介：

公(gong)司實驗室分(fen)離的小(xiao)鼠胚(pei)胎幹采用(yong)分離(li)囊(nang)胚(pei)組(zu)織，去(qu)除(chu)胚(pei)胎透明帶、使(shi)用(yong)特(te)制專用(yong)培養(yang)基(ji)篩(shai)選(xuan)培(pei)養(yang)，消化(hua)傳(chuan)代純(chun)化(hua)制備而(er)來(lai)，細胞(bao)總量約為(wei)5×105cells/瓶(ping)。
質(zhi)量檢(jian)測(ce)：

公(gong)司實驗室分(fen)離的小(xiao)鼠胚(pei)胎幹經Oct-4免疫(yi)熒光(guang)鑒(jian)定，純(chun)度(du)可(ke)達90%以(yi)上，且不(bu)含有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原體(ti)、細(xi)菌(jun)、酵母和(he)真菌(jun)等。

包(bao)被(bei)條件 明(ming)膠(jiao)（0.1%）

培(pei)養(yang)基(ji) 含(han)LIF、BMP、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換(huan)液(ye)頻(pin)率 每(mei)2-3天(tian)換(huan)液(ye)壹(yi)次；

生(sheng)長特(te)性(xing) 貼壁

細(xi)胞(bao)形(xing)態 短(duan)梭(suo)形(xing)、多(duo)角形(xing)

傳(chuan)代(dai)特(te)性(xing) 可(ke)傳(chuan)5-8代(dai)左右

消化(hua)液(ye) 0.025%yi蛋白酶(mei)

培(pei)養(yang)條件 氣(qi)相(xiang)：空(kong)氣(qi)，95%；CO2，5%

準(zhun)備工(gong)作(zuo)

1. 實(shi)驗器材準(zhun)備：準(zhun)備無(wu)菌(jun)的培(pei)養(yang)皿、培養(yang)瓶、移(yi)液(ye)管(guan)、離(li)心管、手(shou)術(shu)器械等，並(bing)進行(xing)高壓滅(mie)菌(jun)或其(qi)他合(he)適(shi)的消毒處理。

2. 試劑準(zhun)備：配(pei)制或(huo)購買合(he)適(shi)的培(pei)養(yang)基(ji)、消化(hua)酶(mei)（如、膠原酶等(deng)）、胎牛血(xue)清、雙(shuang)抗等(deng)試劑，確保其(qi)無(wu)菌(jun)且在(zai)有(you)效期(qi)內(nei)。

3. 實(shi)驗動物(wu)或組織(zhi)來(lai)源準(zhun)備：根(gen)據實驗需求(qiu)，選(xuan)擇(ze)合(he)適(shi)的動(dong)物(wu)並(bing)進行(xing)相應(ying)的麻(ma)醉或處(chu)死，獲(huo)取所需組(zu)織(zhi)；或(huo)從已有(you)的組(zu)織(zhi)樣本(ben)庫(ku)中(zhong)獲(huo)取組織(zhi)。

取材與處(chu)理

1. 取材：在(zai)無(wu)菌(jun)條件下，迅(xun)速(su)取出(chu)目標組織(zhi)，盡(jin)量減(jian)少(shao)對組織(zhi)的損(sun)傷，並(bing)去(qu)除(chu)多(duo)余(yu)的脂肪(fang)、結(jie)締(di)組(zu)織(zhi)等(deng)非目的組(zu)織(zhi)。

2. 清(qing)洗：將取出(chu)的組(zu)織(zhi)用(yong)預冷的無(wu)菌(jun)PBS沖洗數(shu)次，以(yi)去(qu)除(chu)血(xue)液和(he)雜質(zhi)。

3. 剪切：將組織剪成約1 - 2mm³的小(xiao)塊(kuai)，以(yi)便(bian)後續消化(hua)。

細(xi)胞(bao)分(fen)離

1. 消化(hua)：將剪碎的組(zu)織(zhi)塊放(fang)入含(han)有(you)適(shi)量(liang)消化(hua)酶(mei)的離(li)心管中(zhong)，在(zai)37℃恒溫(wen)搖床或(huo)培(pei)養(yang)箱(xiang)中(zhong)消化(hua)壹(yi)段(duan)時間(jian)。期(qi)間(jian)可(ke)輕(qing)輕(qing)搖晃離心管，使(shi)消化(hua)更(geng)均(jun)勻(yun)。

2. 終(zhong)止(zhi)消化(hua)：當組織塊(kuai)大(da)部分(fen)被(bei)消化(hua)成(cheng)單細(xi)胞懸液或小(xiao)細(xi)胞(bao)團(tuan)時，加入(ru)含(han)血(xue)清的培(pei)養(yang)基(ji)終(zhong)止消化(hua)。

3. 過(guo)濾(lv)與離(li)心：用(yong)細胞(bao)篩(shai)過(guo)濾(lv)細(xi)胞(bao)懸液，去(qu)除(chu)未消化(hua)的組(zu)織(zhi)碎片(pian)，然(ran)後(hou)將濾液以適(shi)當的轉速(su)離(li)心，收(shou)集(ji)細胞(bao)沈澱。

細(xi)胞(bao)觀察與檢(jian)測(ce)

1. 日常觀察：每天用(yong)倒(dao)置顯微(wei)鏡觀察細胞的形(xing)態(tai)、生長狀態、密度(du)等(deng)，記(ji)錄細(xi)胞(bao)的變(bian)化情(qing)況，如發(fa)現(xian)細胞(bao)汙(wu)染(ran)或異常，及(ji)時采取相應(ying)措(cuo)施(shi)。
2. 細(xi)胞(bao)計數與活(huo)力(li)檢(jian)測(ce)：在(zai)需要(yao)時，可采用(yong)臺(tai)盼藍染(ran)色等(deng)方(fang)法(fa)對細胞(bao)進(jin)行(xing)計數和(he)活(huo)力(li)檢(jian)測(ce)，以了(le)解(jie)細胞(bao)的生(sheng)長情(qing)況和(he)健康(kang)狀態。

壹(yi)、取材與分(fen)離

1. 快速(su)操(cao)作(zuo)

- 組(zu)織(zhi)取材後需立(li)即(ji)處(chu)理，避(bi)免長時間(jian)暴(bao)露於室溫(wen)或(huo)非(fei)營養(yang)環境(jing)。

- 使(shi)用(yong)無(wu)菌(jun) PBS 或生(sheng)理鹽水(shui)沖(chong)洗組(zu)織，去(qu)除(chu)血(xue)液、雜(za)質(zhi)。

2. 消化(hua)酶(mei)選(xuan)擇(ze)

- 根(gen)據組織(zhi)類(lei)型(xing)選(xuan)擇(ze)消化(hua)酶(mei)，避(bi)免過(guo)度(du)消化(hua)導致細胞損(sun)傷。

- 消化(hua)時間(jian)需嚴格(ge)控(kong)制（通(tong)常 10-30 分(fen)鐘(zhong)），可(ke)通過顯微(wei)鏡觀察細胞解(jie)離狀態。

二(er)、培養(yang)條件優化(hua)

1. 培(pei)養(yang)基(ji)選(xuan)擇(ze)

- 使(shi)用(yong)含血(xue)清或(huo)特(te)定生(sheng)長因(yin)子(zi)的培(pei)養(yang)基(ji)（如 DMEM、RPMI 1640 等），部分(fen)細(xi)胞(bao)需添(tian)加(jia)胰(yi)島(dao)素(su)、EGF 等(deng)。

- 避(bi)免頻(pin)繁(fan)更換(huan)培養(yang)基(ji)品牌或批次(ci)，減(jian)少(shao)細(xi)胞(bao)適(shi)應(ying)壓(ya)力(li)。

2. 貼壁與傳(chuan)代

- 原代細(xi)胞貼壁能力(li)較弱，可(ke)能需要(yao)包(bao)被(bei)培養(yang)皿（如膠原蛋白、多(duo)聚賴(lai)氨(an)酸(suan)）。

- 傳(chuan)代(dai)時密度(du)建(jian)議控(kong)制在(zai) 70%-80%，過度(du)匯(hui)合會(hui)導致接(jie)觸抑(yi)制和(he)分化(hua)。

三、汙(wu)染(ran)控(kong)制

1. 無(wu)菌(jun)操作(zuo)

- 全(quan)程(cheng)在(zai)超(chao)凈臺(tai)操作，使(shi)用(yong)壹(yi)次性(xing)耗材，避(bi)免交叉(cha)汙(wu)染(ran)。

- 培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)可(ke)添(tian)加(jia)雙抗，但(dan)長期(qi)使(shi)用(yong)可能影響細胞(bao)活(huo)性。

2. 支(zhi)原體(ti)檢(jian)測(ce)

- 定期(qi)檢(jian)測(ce)支(zhi)原體(ti)汙(wu)染(ran)（如 PCR 法），汙(wu)染(ran)後需及(ji)時丟棄(qi)細(xi)胞。

四(si)、狀態監控(kong)

1. 日常觀察

- 每(mei)天(tian)檢(jian)查細胞形態(tai)、密度(du)及(ji)培養(yang)基(ji)顏色(se)，及(ji)時更換(huan)培(pei)養(yang)基(ji)（通(tong)常每(mei) 2-3 天(tian)換液壹(yi)次）。

- 異常形(xing)態(tai)（如細胞(bao)變(bian)圓(yuan)、碎片(pian)增(zeng)多(duo)）可能提示汙染(ran)或營養(yang)不(bu)足。

2. 傳(chuan)代(dai)與凍存(cun)

- 原代細(xi)胞分裂(lie)次(ci)數有(you)限(xian)（壹(yi)般(ban) 5-10 代(dai)），需及(ji)時凍存(cun)早(zao)期(qi)代(dai)次細胞(bao)。

- 凍存(cun)液(ye)建(jian)議使(shi)用(yong) DMSO+血(xue)清（或(huo)專用(yong)凍存(cun)培(pei)養(yang)基(ji)），梯度(du)降溫(wen)後(hou)液(ye)氮(dan)保存(cun)。