【概要描述】小鼠肝(gan)炎(yan)病毒探針(zhen)法(fa)熒光(guang)定(ding)量 RT-PCR試(shi)劑(ji)盒(he)本產品(pin)就(jiu)是以(yi)探針(zhen)法(fa)熒光(guang)定(ding)量 RT-PCR 技(ji)術(shu)為基礎開(kai)發(fa)的(de)專門(men)檢(jian)測(ce)小鼠肝(gan)炎(yan)病毒的(de)試劑(ji)盒(he)

【產(chan)品名(ming)稱(cheng)】小鼠肝(gan)炎(yan)病毒探針(zhen)法(fa)熒光(guang)定(ding)量 RT-PCR試劑(ji)盒(he)

Name  ：MouseHepatitisVirus(MHV)ProbegRT-PCRKit

【包(bao)裝規格】50次(ci)/盒(he)                                                                    

【預(yu)期(qi)用(yong)途(tu)】小鼠肝(gan)炎(yan)病毒(MouseHepatitisVirus ，MHV)是壹種(zhong) RNA 病毒 ，病毒存(cun)在(zai)於血液和(he)內(nei)臟(zang) ，特別(bie)是 肝(gan)和(he)腎(shen) ，也(ye)見(jian)於糞尿(niao)中(zhong) ，對(dui)幼鼠有(you)高(gao)度的(de)傳染(ran)性(xing) ，小(xiao)鼠肝(gan)炎(yan)是由(you) MHV 所(suo)致(zhi)的(de) 1 種的(de)傳染(ran)病 ，帶毒 小鼠分布(bu)於，但在(zai)正常情況下大(da)多呈不顯(xian)性(xing)感染(ran) ，只在(zai)應(ying)激因(yin)素(su)激(ji)發(fa)下(xia)才能成為致(zhi)死(si)性(xing)疾病 ，主 要(yao)為肝(gan)炎(yan)和(he)腦(nao)炎(yan) ， 因(yin)此小鼠肝(gan)炎(yan)病毒的(de)快速(su)準(zhun)確(que)鑒定(ding)對(dui)該(gai)病的(de)預(yu)防(fang)和(he)檢(jian)疫(yi)有著重要(yao)作用 。本產品(pin)就(jiu)是以(yi)探針(zhen)法(fa)熒光(guang)定(ding)量 RT-PCR 技(ji)術(shu)為基礎開(kai)發(fa)的(de)專門(men)檢(jian)測(ce)小鼠肝(gan)炎(yan)病毒的(de)試劑(ji)盒(he) ，它具有(you)下(xia)列(lie)特點(dian)：

1.即開即(ji)用(yong) ，用戶(hu)只需要(yao)提(ti)供(gong)樣品 RNA 模(mo)板(ban)。

2.引物和(he)探針(zhen)經(jing)過優(you)化 ，靈(ling)敏性(xing)高(gao)。

3.提(ti)供(gong)陽性對照(zhao) ，便(bian)於區分假陰(yin)性樣品。

4.特異(yi)性(xing)高(gao) ，引物是根據(ju)小(xiao)鼠肝(gan)炎(yan)病毒高(gao)度保(bao)守(shou)區設(she)計，不會跟(gen)其(qi)他病毒的(de)RNA 發生(sheng)交(jiao)叉(cha)反(fan)應(ying)。

5.本產品(pin)足(zu)夠 50 次(ci) 20μL 體(ti)系(xi)的(de)探針(zhen)法(fa)熒光(guang)定(ding)量 RT-PCR 反(fan)應(ying)。

6.本產品(pin)只能(neng)用(yong)於科研。

【規格及成(cheng)分】

【運(yun)輸及保(bao)存(cun)】低溫(wen)運輸，-20℃保(bao)存(cun)，保(bao)存(cun)期(qi)限(xian)為 12 個月(yue)。

【自備(bei)試劑(ji)】樣品 RNA。

小鼠肝(gan)炎(yan)病毒探針(zhen)法(fa)熒光(guang)定(ding)量 RT-PCR試(shi)劑(ji)盒(he)【使用(yong)方法】壹、稀(xi)釋標準曲線樣品 (以(yi) 10E2- 10E6 拷(kao)貝(bei)/μL 這(zhe) 6 個 10 倍(bei)稀(xi)釋度為例(li))由(you)於標準(zhun)品濃(nong)度非常(chang)高(gao) ，   因(yin)此下列(lie)稀(xi)釋操(cao)作壹定(ding)要在(zai)獨立的(de)區域(yu)進(jin)行 ，千(qian)萬(wan)不能(neng)汙染(ran)樣品或(huo)本試劑(ji)盒(he)的(de)其(qi)他成(cheng)分 。為增(zeng)加(jia)產(chan)品(pin)穩定性和(he)避(bi)免擴(kuo)散(san)傳染(ran)性(xing)病原 ，本產品(pin)不提(ti)供(gong)活體(ti)樣品做(zuo)陽性對照(zhao) ，只提(ti)供(gong)無傳(chuan)染(ran)性(xing)的(de) DNA 片段(duan)作為陽性對照(zhao) 。

1.標記 6 個離(li)心管 ，分別(bie)為 6 ，  5 ，  4 ，  3 ，  2, 1。

2.用帶芯(xin)槍頭(tou)分別(bie)加入 45μL 熒光(guang) PCR 專用(yong)模(mo)板(ban)稀(xi)釋液   (最(zui)好(hao)用帶(dai)芯(xin)槍頭(tou)  ，  下同(tong)) 。

3.在 6 號管(guan)中(zhong)加(jia)入 5μL1  ×  10E7 拷(kao)貝(bei)/μL 的(de)陽性對照(zhao)   (試劑(ji)盒(he)提(ti)供(gong)) ，充分震蕩 1 分鐘 ，得(de) 1  × 10E6 拷(kao)貝(bei)/μL 的(de)標準(zhun)曲線(xian)樣品 。放(fang)冰上待(dai)用(yong)。

4.換槍頭(tou) ，在 5 號管(guan)中(zhong)加(jia)入 5μL1  ×  10E6 拷(kao)貝(bei)/μL 的(de)陽性對照(zhao)(上步(bu)稀(xi)釋所(suo)得(de)) ，充分震蕩 1 分鐘， 得(de) 1 × 10E5 拷(kao)貝(bei)/μL 的(de)標準(zhun)曲線(xian)樣品 。放(fang)冰上待(dai)用(yong)。

5.換槍頭(tou)  ，在 4 號管(guan)中(zhong)加(jia)入 5μL1  ×  10E5 拷(kao)貝(bei)/μL 的(de)陽性對照(zhao)  (上步(bu)稀(xi)釋所(suo)得(de)) ，充分震蕩  1 分 鐘 ，得(de) 1 × 10E4 拷(kao)貝(bei)/μL 的(de)標準(zhun)曲線(xian)樣品 。放(fang)冰上待(dai)用(yong)。

6.重復(fu)上面(mian)的(de)操(cao)作直到得到 6 個稀(xi)釋度的(de)標準(zhun)曲線(xian)樣品 。放(fang)冰上用(yong) 。

二(er)、樣品 RNA 的(de)制(zhi)備(bei)

7 .如果有(you) N 個樣品 ，最(zui)好(hao)設(she)置 N+2 個提(ti)取(qu)  ， 多出(chu)的(de)壹個是 PC (樣品制(zhi)備(bei)陽性對照(zhao))  ，壹個是 NC (樣品制(zhi)備(bei)陰(yin)性(xing)對照) 。可以(yi)用  10μL 陽性對照(zhao)的(de)  10000 倍(bei)稀(xi)釋液再(zai)加上壹定(ding)量的(de)水(shui)使總(zong)體(ti)積跟(gen)每次(ci)制(zhi)備(bei)要(yao)求(qiu)的(de)體積(ji)壹樣 ，  以(yi)此作為 PC 。  另外用(yong)水(shui)作為 NC。

8 .用自選(xuan)方法純(chun)化樣品的(de) RNA  ，  本試劑(ji)盒(he)跟市(shi)場(chang)上大(da)多數(shu)病毒 RNA 提(ti)取(qu)試(shi)劑(ji)盒(he)兼容。

三ProbeqRT-PCR反(fan)應(ying) (20μL 體(ti)系，在樣品制(zhi)備(bei)室(shi)進(jin)行)

9 .如果做(zuo)定量分析(xi)並(bing)且只做(zuo)  1 次(ci)重復(fu) ，則(ze)標記(ji) N+9 個 PCR 管(guan) ，其(qi)中(zhong) N+2 個用(yong)於上步(bu)得(de)到的(de) N+2 個樣品 ，  1 個用(yong)於 PCR 陰性(xing)對照(zhao)  (用(yong)水(shui)做(zuo)模板(ban)) ，  6 個用(yong)於標準(zhun)曲線(xian) 。如(ru)果(guo)做(zuo)定性(xing)分析(xi) ，  並(bing)且 只做(zuo) 1 次(ci)重復(fu) ，則(ze)標記(ji) N+4 個 PCR 管(guan) ，  其(qi)中(zhong) N+2 個用(yong)於上步(bu)得(de)到的(de) N+2 個樣品  ，   1 個用(yong)於 PCR 陰性(xing)對照(zhao) (用(yong)水(shui)做(zuo)模板(ban))  ， 1 個用(yong)於 PCR 陽性對照(zhao) (用第 4 號管(guan)中(zhong)的(de)陽性對照(zhao)稀(xi)釋液做(zuo)模板(ban)) 。  下面(mian)只以(yi)定量分析(xi)為描述操(cao)作步驟(zhou)，

10 . 在標記(ji)管(guan)中(zhong)按(an)下表加入各(ge)成分   (本表只列(lie)出(chu)壹次(ci)重復(fu)  。樣品管(guan)和(he)陰(yin)性(xing)對(dui)照設(she)置完(wan)畢(bi)後才設(she)置陽 性對照(zhao) ，  並(bing)且陽性對照(zhao)樣品要(yao)等(deng)所(suo)有(you)管(guan)子(zi)蓋(gai)上蓋(gai)子(zi)儲(chu)存(cun)好(hao)後最後加)  

11.蓋(gai)上蓋(gai)子(zi)後上機，按(an)下(xia)面(mian)參(can)數(shu)進(jin)行 qRT-PCR：

四：數(shu)據(ju)處(chu)理

12. 如果把(ba)本試劑(ji)盒(he)用於定量檢(jian)測(ce) ，  則(ze)以(yi)陽性對照(zhao)濃(nong)度的(de) log 值為橫軸(zhou)  ，  以(yi) Ct 值為縱(zong)軸(zhou) ，  繪(hui)制(zhi)標(biao) 準(zhun)曲(qu)線 。再以(yi)待測(ce)樣品的(de) Ct 值從(cong)標準(zhun)曲(qu)線(xian)上推(tui)算出(chu)樣品 RNA 濃(nong)度的(de) log 值 ，再推(tui)算出(chu)其(qi)濃(nong)度。

13 . 如果把(ba)本試劑(ji)盒(he)用於定性(xing)檢測(ce)  ，只判(pan)斷(duan)陽性或(huo)陰(yin)性  ，則(ze)陰性(xing)對照(zhao) Ct 必須(xu)大(da)於或(huo)等(deng)於 40 。  陽 性對照(zhao)必須(xu)有(you)熒光(guang)對(dui)數(shu)增(zeng)長(chang) ，有(you)典(dian)型(xing)擴增(zeng)曲(qu)線(xian) ，Ct 值應(ying)該小(xiao)於或(huo)等(deng)於 30 。對待(dai)測(ce)樣品 ，如(ru)果 其(qi) Ct 大(da)於或(huo)等(deng)於 40 則(ze)為陰性 ，  如果(guo)小於或(huo)等(deng)於 35 則(ze)為陽性 。  如果(guo)在 35-40 之(zhi)間  ，則(ze)重復(fu)壹次(ci) 。重復(fu)實驗的(de) Ct 值如果(guo)大(da)於或(huo)等(deng)於 40 則(ze)為陰性  ，如果(guo)小於 35 ，則(ze)為陽性。