【概(gai)要描述(shu)】NM23免(mian)疫組(zu)化(hua)檢測(ce)試(shi)劑盒 Western免(mian)疫印(yin)跡(Western Blot)是(shi)將蛋白(bai)質(zhi)轉移到膜(mo)上(shang)，然(ran)後利(li)用抗體進行檢(jian)測(ce)。

NM23免(mian)疫組(zu)化(hua)檢測(ce)試(shi)劑盒 Western Blot技術:

壹(yi)、 原(yuan)理

與(yu)Southern或(huo)Northern雜(za)交(jiao)方法(fa)類(lei)似，但Western Blot采用的(de)是(shi)聚丙(bing)烯(xi)酰胺(an)凝膠(jiao)電泳，被(bei)檢測(ce)物(wu)是(shi)蛋白(bai)質(zhi)，“探針(zhen)”是(shi)抗體，“顯(xian)色(se)”用標(biao)記(ji)的(de)二(er)抗。經過PAGE分(fen)離(li)的蛋白(bai)質(zhi)樣品，轉移到固相(xiang)載體（例如(ru)硝#纖(xian)維素(su)薄膜(mo)）上(shang)，固相(xiang)載體以(yi)非(fei)共(gong)價(jia)鍵形式吸(xi)附(fu)蛋白(bai)質(zhi)，且(qie)能保持電泳分(fen)離(li)的多(duo)肽類(lei)型及其生物(wu)學(xue)活性不變(bian)。以(yi)固(gu)相載體上(shang)的蛋白(bai)質(zhi)或(huo)多(duo)肽(tai)作(zuo)為抗原，與(yu)對應的(de)抗體起(qi)免(mian)疫反(fan)應，再(zai)與(yu)酶或(huo)同位素(su)標記(ji)的第(di)二(er)抗體起(qi)反應，經過底物(wu)顯(xian)色(se)或(huo)放(fang)射自(zi)顯(xian)影(ying)以(yi)檢測(ce)電泳分(fen)離(li)的特異(yi)性目(mu)的基因表達(da)的蛋白(bai)成(cheng)分。該(gai)技術也廣(guang)泛應用(yong)於檢測(ce)蛋白(bai)水(shui)平的(de)表達(da)。

二(er)、分類(lei)NM23免(mian)疫組(zu)化(hua)檢測(ce)試(shi)劑盒現(xian)常(chang)用的(de)有(you)底物(wu)化學(xue)發光ECL和底物(wu)DAB呈(cheng)色(se)，體(ti)同水平和(he)實(shi)驗(yan)條(tiao)件(jian)的是(shi)用*種方法(fa)，目(mu)前發表文章(zhang)通常(chang)是(shi)用底物(wu)化學(xue)發光ECL。只(zhi)要買現(xian)成(cheng)的試(shi)劑盒就(jiu)行(xing)，操(cao)作(zuo)也比較簡(jian)單，原(yuan)理如(ru)下(xia)（二(er)抗用HRP標(biao)記(ji)）：反(fan)應底物(wu)為過氧化(hua)物(wu)+魯米(mi)諾，如(ru)遇到(dao)HRP，即(ji)發光，可(ke)使(shi)膠(jiao)片(pian)曝(pu)光，就可(ke)洗(xi)出(chu)條(tiao)帶(dai)。

三、 主要試(shi)劑

、 丙(bing)烯(xi)酰胺(an)和N，N’-亞甲(jia)雙丙(bing)烯(xi)酰胺(an)，應以(yi)溫熱（以利(li)於溶解雙丙(bing)稀酰胺(an)）的去離(li)子水(shui)配(pei)制(zhi)含(han)有(you)29%（w/v）丙(bing)稀酰胺(an)和%（w/v）N，N’-亞甲(jia)雙丙(bing)烯(xi)酰胺(an)儲存液(ye)丙(bing)稀酰胺(an)29g，N，N-亞甲(jia)叉雙丙(bing)稀酰胺(an)g，加H2O至(zhi) 00ml。）儲於棕色(se)瓶(ping)，4℃避(bi)光保存。嚴格核(he)實(shi)PH不得超(chao)過7.0，因(yin)可(ke)以(yi)發生脫(tuo)氨基反應是(shi)光催(cui)化或(huo)堿催(cui)化的(de)。使用期不得超(chao)過兩(liang)個(ge)月，隔幾個(ge)月須(xu)重(zhong)新(xin)配(pei)制(zhi)。如(ru)有沈澱(dian)，可(ke)以(yi)過(guo)濾。

2、 十二(er)烷基硫(liu)#鈉SDS溶(rong)液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子水(shui)配(pei)制(zhi)，室溫(wen)保存。

3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩沖液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合，加水(shui)稀釋到00ml終(zhong)體(ti)積(ji)。過濾後40℃保存。

4、 濃(nong)縮膠(jiao)緩沖液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於40mlH2O中，用(yong)約48ml mol/L HCl調(tiao)至(zhi)pH6.8加水(shui)稀釋到00ml終(zhong)體(ti)積(ji)。過濾後40C保存。這兩種緩沖液必須(xu)使(shi)用(yong)Tris堿制備(bei)，再(zai)用HCL調(tiao)節(jie)PH值(zhi)，而(er)不用 Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液(ye)N，N，N’N’四甲(jia)基乙二(er)胺(an)催(cui)化過(guo)硫(liu)#銨(an)形(xing)成(cheng)自(zi)由基而(er)加速(su)兩種丙(bing)稀酰胺(an)的聚(ju)合。PH太(tai)低時(shi)，聚合反(fan)應受(shou)到抑(yi)制(zhi)。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺(an)溶液(ye)。提供兩種丙(bing)稀酰胺(an)聚合所(suo)必須(xu)的(de)自(zi)由基。去離(li)子水(shui)配(pei)制(zhi)數(shu)ml，臨(lin)用(yong)前配(pei)制(zhi).

6、 SDS- PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘(gan)油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍(lan).6ml，H2O 32ml混勻(yun)備(bei)用。按(an):或(huo):2比(bi)例與(yu)蛋白(bai)質(zhi)樣品混(hun)合，在沸水終煮(zhu)3min混(hun)勻後再(zai)上(shang)樣，壹般為20-25ul，總蛋白(bai)量(liang)00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨#電泳緩沖液:30.3gTris，88g甘(gan)氨#，0gSDS，用(yong)蒸餾(liu)水(shui)溶(rong)解至(zhi)000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨#電極緩沖液。臨(lin)用(yong)前稀釋0倍(bei)。

8、 轉移緩沖液：配(pei)制(zhi)L轉移緩沖液，需(xu)稱取(qu)2.9g甘(gan)氨#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並加入(ru)200ml甲(jia)醇，加水(shui)至(zhi)總(zong)量(liang)L。

9、 麗(li)春(chun)紅(hong)染液儲存液(ye)：麗(li)春紅S 2g 三#乙(yi)#30g 磺(huang)基水楊# 30g 加水(shui)至(zhi)00ml 用(yong)時(shi)上(shang)述(shu)儲存液(ye)稀釋0倍(bei)即(ji)成(cheng)麗春(chun)紅S使用液(ye)。使(shi)用後應予(yu)以廢棄(qi)。

0、 脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉（有(you)毒，戴手(shou)套操(cao)作(zuo)），溶於磷#緩沖鹽溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖鹽溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗人-MMP-9（6）鼠(shu)抗人-TIMP-。

4、 過(guo)氧化(hua)物(wu)酶標記的(de)第(di)二(er)抗體。

5、 NBT（溶(rong)於70%二(er)甲(jia)基甲(jia)酰(xian)胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於00%二(er)甲(jia)基甲(jia)酰(xian)胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。（可(ke)以(yi)參看分(fen)子(zi)克(ke)隆）