【概要描(miao)述(shu)】豬(zhu)骨(gu)髓間(jian)充質幹細胞的相關(guan)產(chan)品：A549/OVA人(ren)肺(fei)癌(ai)細胞大(da)鼠原(yuan)代(dai)腎(shen)上腺(xian)髓質細胞兔(tu)原(yuan)代(dai)氣管平滑肌細(xi)胞人原(yuan)代(dai)主(zhu)動脈外(wai)膜成(cheng)纖(xian)維細胞小鼠原(yuan)代(dai)腹(fu)腔(qiang)巨(ju)噬(shi)細胞大(da)鼠原(yuan)代(dai)膀胱平滑肌細(xi)胞人原(yuan)代(dai)膽(dan)囊微(wei)血(xue)管內皮(pi)細胞兔(tu)原(yuan)代(dai)晶狀體(ti)上皮細(xi)胞人原(yuan)代(dai)鼻(bi)粘膜上皮細(xi)胞牛(niu)原(yuan)代(dai)結(jie)直腸(chang)黏(nian)膜上皮細(xi)胞

豬骨(gu)髓間(jian)充質幹細胞

培養(yang)基 含(han)FBS、生長添(tian)加(jia)劑、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液頻(pin)率 每(mei)2-3天(tian)換液壹(yi)次

生長特(te)性 貼壁(bi)

細胞形態 成纖(xian)維細胞樣

傳代(dai)特(te)性 可傳5代(dai)左(zuo)右；3代(dai)以內狀態

消(xiao)化液 0.25%yi蛋白(bai)酶(mei)

培養(yang)條(tiao)件(jian) 氣相：空(kong)氣，95%；CO2，5%

豬骨(gu)髓間(jian)充質（BMSC）分離自(zi)骨(gu)髓；骨(gu)髓是(shi)機體(ti)的造血(xue)組織，位(wei)於(yu)身(shen)體(ti)的許多骨(gu)骼內。成年(nian)動(dong)物(wu)的骨(gu)髓分(fen)兩種(zhong)：紅骨(gu)髓和(he)黃(huang)骨(gu)髓。紅(hong)骨(gu)髓能(neng)制造(zao)紅細胞、血(xue)小板和(he)各種(zhong)白細(xi)胞。血(xue)小板有止血(xue)作(zuo)用(yong)，白(bai)細(xi)胞能殺滅(mie)與(yu)抑(yi)制(zhi)各種(zhong)病原(yuan)體(ti)，包括(kuo)細菌、病(bing)毒(du)等(deng)；某(mou)些淋巴細胞能制造抗(kang)體(ti)。因此，骨(gu)髓不但(dan)是造(zao)血(xue)器官，它還是重要的免(mian)疫(yi)器官。骨(gu)髓是(shi)存在(zai)於(yu)長骨(gu)（如肱(gong)骨(gu)、股骨(gu)）的骨(gu)髓腔(qiang)和(he)扁平骨(gu)（如髂(qia)骨(gu)）的稀松骨(gu)質間的網眼中(zhong)，是壹種(zhong)海(hai)綿狀的組織，能產生血(xue)細(xi)胞的骨(gu)髓略呈紅(hong)色，稱(cheng)為紅(hong)骨(gu)髓。出(chu)生時(shi)，紅(hong)骨(gu)髓充(chong)滿全(quan)身(shen)骨(gu)髓腔(qiang)，隨(sui)著(zhe)年(nian)齡(ling)增大(da)，脂肪(fang)細胞增多，相當(dang)部分(fen)紅(hong)骨(gu)髓被(bei)黃骨(gu)髓取代(dai)，最後(hou)幾(ji)乎只有扁平骨(gu)骨(gu)髓腔(qiang)中(zhong)有紅骨(gu)髓。骨(gu)髓基質系統內存(cun)在(zai)的骨(gu)髓間(jian)充質幹細胞是壹種(zhong)除造(zao)血(xue)幹細胞以外(wai)的、具有(you)高(gao)度自(zi)我(wo)更(geng)新能力(li)和(he)多向(xiang)分(fen)化(hua)潛能的幹細胞，可以向骨(gu)、軟(ruan)骨(gu)、肌組織、皮膚(fu)、脂(zhi)肪(fang)、神(shen)經(jing)等(deng)多種(zhong)組織分化，因此可以作為組織工程(cheng)中(zhong)的種(zhong)子(zi)細胞。在(zai)骨(gu)髓中(zhong)，BMSC占(zhan)骨(gu)髓有(you)核細(xi)胞總(zong)數的0.001%-0.1%，含(han)量極(ji)低。骨(gu)髓間(jian)充質幹細胞的體(ti)外(wai)培養(yang)條(tiao)件(jian)要求較高(gao)，在(zai)培養(yang)過(guo)程(cheng)中(zhong)，受貼壁(bi)時(shi)間(jian)、種(zhong)植密(mi)度、血(xue)清含(han)量、培養(yang)溫度和(he)培養(yang)基pH值等(deng)條件(jian)的影響。
方法簡介：

公司實(shi)驗(yan)室分離的豬骨(gu)髓間(jian)充質幹采用(yong)沖(chong)洗骨(gu)髓、密(mi)度梯度離心(xin)、差速貼壁(bi)法結(jie)合培養(yang)基篩選(xuan)制備(bei)而(er)來(lai)，細(xi)胞總(zong)量約為5×10?cells/瓶。
質量檢(jian)測(ce)：

公司實(shi)驗(yan)室分離的豬骨(gu)髓間(jian)充質幹經CD90免(mian)疫(yi)熒(ying)光(guang)鑒(jian)定(ding)，純度可(ke)達90%以上，且不含(han)有HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原(yuan)體(ti)、細菌、酵(jiao)母(mu)和(he)真(zhen)菌等(deng)。

壹、細(xi)胞培養(yang)

1取材 在(zai)無(wu)菌環境(jing)下從機體(ti)取出(chu)某(mou)種(zhong)組織細胞（視實驗目的而定(ding)），經過(guo)壹(yi)定(ding)的處理（如消(xiao)化分散細胞、分離等(deng)）後接(jie)入(ru)培養(yang)器血(xue)中(zhong)，這壹過程(cheng)稱(cheng)為(wei)取材。如是(shi)細胞株(zhu)的擴大(da)培養(yang)則無(wu)取材這壹(yi)過程(cheng)。機(ji)體(ti)取出(chu)的組織細胞的培養(yang)稱(cheng)為原(yuan)代(dai)培養(yang)。2培養(yang) 將(jiang)取得的組織細胞接入(ru)培養(yang)瓶(ping)或培養(yang)板(ban)中(zhong)的過程(cheng)稱(cheng)為(wei)培養(yang)。3凍(dong)存及(ji)復(fu)蘇（可參(can)閱(yue)後(hou)面有關章(zhang)節(jie)）為(wei)了保(bao)存(cun)細(xi)胞，特(te)別是不易獲得的突(tu)變型細(xi)胞或細胞株(zhu)，要將(jiang)細胞凍(dong)存。凍(dong)存的溫度壹(yi)般(ban)用(yong)液氮(dan)的溫度－196℃，將(jiang)細胞收集至(zhi)凍(dong)存管中(zhong)加(jia)入(ru)含(han)保護劑（壹般(ban)為(wei)二甲(jia)亞(ya)碸(feng)或甘(gan)油）的培養(yang)基，以壹定(ding)的冷(leng)卻(que)速(su)度凍(dong)存，最終(zhong)保存於(yu)液氮(dan)中(zhong)。在(zai)極(ji)低的溫度下(xia)，細(xi)胞保存的時(shi)間(jian)幾(ji)乎是無(wu)限的。復蘇壹般(ban)采(cai)用(yong)快(kuai)融(rong)方(fang)法，即從液氮(dan)中(zhong)取出(chu)凍(dong)存管後，立(li)即放(fang)入(ru)37℃水中(zhong)，使(shi)之在(zai)壹(yi)分(fen)鐘內迅(xun)速(su)融(rong)解(jie)。然後將(jiang)細胞轉(zhuan)入(ru)培養(yang)器皿中(zhong)進行(xing)培養(yang)。

二、原(yuan)代(dai)細(xi)胞分離

凡(fan)是來(lai)源(yuan)於(yu)胚(pei)胎(tai)、組織器官及外(wai)周血(xue)，經(jing)特(te)殊(shu)分離方(fang)法制備(bei)而來(lai)的原(yuan)初培養(yang)的細胞稱之為(wei)原(yuan)代(dai)細(xi)胞。1懸浮(fu)細(xi)胞的分離方(fang)法組織材料(liao)若(ruo)來(lai)自(zi)血(xue)液、羊(yang)水、胸(xiong)水或腹(fu)水的懸液材料(liao)，的方法是采(cai)用1000r/min的低速離心(xin)10分(fen)鐘。經離心(xin)後(hou)由於(yu)各種(zhong)細胞的比(bi)重不同可在(zai)分(fen)層(ceng)液中(zhong)形成不同層，這樣可(ke)根據(ju)需(xu)要收獲目的細胞。2實體(ti)組織材料(liao)的分離方(fang)法對(dui)於(yu)實體(ti)組織材料(liao)，由於(yu)細(xi)胞間結(jie)合緊密，為(wei)了使(shi)組織中(zhong)的細胞充分分散(san)，形成(cheng)細胞懸液，可(ke)采用(yong)機械(xie)分散(san)法（物理裂解(jie)）和(he)消(xiao)化分離法。

三(san)、細胞增殖(zhi)檢(jian)測(ce)技(ji)術

目前(qian)主(zhu)要有兩種(zhong)用於(yu)檢(jian)測(ce)細(xi)胞增殖(zhi)能(neng)力(li)的方法。壹種(zhong)是直(zhi)接(jie)的方法，通過(guo)直接測(ce)定(ding)進行(xing)分裂(lie)

的細胞數來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞的增殖(zhi)能(neng)力(li)。另壹(yi)種(zhong)是間(jian)接(jie)的方法，即細(xi)胞活(huo)力(li)（cell viability）檢測(ce)方(fang)法，通過(guo)檢測(ce)樣品中(zhong)健(jian)康細(xi)胞的數目來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞的增殖(zhi)能(neng)力(li)。顯然，細胞活(huo)力(li)檢測(ce)法並(bing)不能最終(zhong)證(zheng)明檢測(ce)樣品中(zhong)的細胞是否在(zai)增(zeng)殖(zhi)。如(ru)細胞在(zai)某(mou)壹培養(yang)條(tiao)件(jian)下(xia)會(hui)自(zi)發(fa)啟動雕亡(wang)程(cheng)序(xu)，但(dan)藥物(wu)的幹擾可(ke)抑(yi)制(zhi)雕亡(wang)的發(fa)生；這(zhe)時(shi)若(ruo)采用(yong)細(xi)胞活(huo)力(li)檢測(ce)法，顯然可以區分兩種(zhong)條件(jian)下(xia)的細胞數量，但(dan)我們(men)並(bing)不能從藥物(wu)幹擾組細胞數大(da)於對(dui)照組的事(shi)實(shi)說(shuo)明藥物(wu)可(ke)促(cu)進細(xi)胞增殖(zhi)的結(jie)論(lun)。所以最直(zhi)接的證(zheng)據(ju)應(ying)該(gai)采(cai)用(yong)方法壹。

取材：首先(xian)，用培養(yang)液濕(shi)潤所(suo)取的組織材料(liao)，並(bing)用(yong)鋒利(li)的眼科剪去(qu)除附(fu)在(zai)其上的脂肪(fang)和(he)結(jie)締組織。接著(zhe)用平(ping)衡液（如(ru)PBS或Hanks液）漂洗，再(zai)用眼(yan)科彎剪將(jiang)組織塊剪成(cheng)小塊。多次用PBS或(huo)Hanks液漂洗，直(zhi)到(dao)液體(ti)清亮、無(wu)油滴為(wei)止(zhi)。

接種(zhong)：用濕(shi)潤的吸管吸取切碎(sui)的組織塊，輕輕(qing)吹(chui)到(dao)培養(yang)瓶(ping)皿中(zhong)，並(bing)按(an)壹(yi)定(ding)間距(ju)均勻放(fang)在(zai)培養(yang)瓶(ping)底壁上。註(zhu)意不要過多，確(que)保(bao)組織塊切面(mian)貼在(zai)培養(yang)瓶(ping)底壁上。

培養(yang)：將(jiang)培養(yang)瓶(ping)翻(fan)轉(zhuan)，使(shi)瓶底朝(chao)上，在(zai)種(zhong)植了組織塊壹側(ce)的對(dui)側(ce)面加(jia)足培養(yang)液，避(bi)免(mian)組織塊與培養(yang)液接(jie)觸(chu)，然後塞(sai)緊瓶塞(sai)。將(jiang)種(zhong)植了組織塊的壹側朝(chao)上，靜(jing)置(zhi)於(yu)37℃培養(yang)箱(xiang)中(zhong)。待組織塊貼壁(bi)1到(dao)3小時(shi)後(hou)翻(fan)瓶(ping)，使(shi)貼壁(bi)的組織塊浸沒(mei)在(zai)培養(yang)液中(zhong)，繼續(xu)靜(jing)置(zhi)。換液：每(mei)隔2到(dao)3天(tian)更(geng)換壹次培養(yang)液，或(huo)者根據(ju)培養(yang)瓶(ping)種(zhong)顏(yan)色的變化確(que)定(ding)換液時(shi)間(jian)。

壹、原(yuan)代(dai)細(xi)胞計數

將(jiang)血(xue)球計(ji)數(shu)板(ban)及(ji)蓋(gai)片用(yong)擦試(shi)幹凈，並(bing)將(jiang)蓋片蓋(gai)在(zai)計(ji)數(shu)板(ban)上。

將(jiang)細胞懸液吸出(chu)少(shao)許，滴(di)加(jia)在(zai)蓋(gai)片邊(bian)緣，使(shi)懸液充(chong)滿蓋(gai)片和(he)計(ji)數(shu)板之間(jian)。

靜(jing)置(zhi)3分(fen)鐘。

鏡(jing)下(xia)觀察(cha)，計(ji)算(suan)計數(shu)板四大(da)格細(xi)胞總(zong)數，壓(ya)線(xian)細(xi)胞只計左(zuo)側和(he)上方的。然後按(an)下(xia)式(shi)計算(suan)：

細胞數/ml＝4大(da)格細(xi)胞總(zong)數/ 4×10000

註(zhu)意：鏡(jing)下(xia)偶見由兩(liang)個(ge)以上細胞組成的細胞團，應按(an)單(dan)個(ge)細胞計算(suan)，若(ruo)細胞團占(zhan)10%以上，說(shuo)明分散不好，需(xu)重新制備(bei)細(xi)胞懸液。

二、原(yuan)代(dai)細(xi)胞活(huo)力(li)

將(jiang)細胞懸液以0.5ml加(jia)入(ru)試(shi)管中(zhong)。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺(tai)盼蘭染液，染色2壹(yi)3分鐘。

吸取少許懸(xuan)液塗於載(zai)玻片上，加(jia)上蓋片。

鏡(jing)下(xia)取幾(ji)個(ge)任意(yi)視野(ye)分別計死(si)細(xi)胞和(he)活(huo)細胞數，計細胞活(huo)力(li)。

死(si)細(xi)胞能被(bei)臺(tai)盼蘭染上色，鏡(jing)下(xia)可(ke)見深蘭色的細胞，活(huo)細胞不被(bei)染色，鏡(jing)下(xia)呈(cheng)無(wu)色透明狀。

活(huo)力(li)測(ce)定(ding)可以和(he)細(xi)胞計數合起(qi)來(lai)進行(xing)，但(dan)要考慮到(dao)染液對(dui)原(yuan)細胞懸液的加(jia)倍稀(xi)釋(shi)作(zuo)用(yong)。