【概(gai)要描述】P6 免(mian)疫組(zu)化檢測(ce)試劑盒 Western免(mian)疫(yi)印跡(Western Blot)是將蛋(dan)白(bai)質(zhi)轉移(yi)到(dao)膜上(shang)，然後利用(yong)抗體(ti)進(jin)行(xing)檢(jian)測(ce)。

P6 免疫組(zu)化檢測(ce)試劑盒   Western Blot技(ji)術(shu):

壹(yi)、 原理(li)

與(yu)Southern或(huo)Northern雜(za)交方(fang)法(fa)類似，但Western Blot采(cai)用(yong)的(de)是聚丙烯酰(xian)胺(an)凝膠(jiao)電(dian)泳，被(bei)檢(jian)測(ce)物是蛋白(bai)質(zhi)，“探(tan)針(zhen)”是抗體(ti)，“顯(xian)色”用(yong)標(biao)記的(de)二抗。經過PAGE分(fen)離的(de)蛋白(bai)質(zhi)樣品，轉移(yi)到(dao)固相載體(ti)（例(li)如(ru)硝(xiao)#纖(xian)維素薄(bo)膜）上(shang)，固(gu)相載體(ti)以非(fei)共(gong)價(jia)鍵(jian)形(xing)式吸(xi)附(fu)蛋白(bai)質(zhi)，且能保(bao)持電(dian)泳分(fen)離的(de)多(duo)肽(tai)類型(xing)及(ji)其(qi)生物(wu)學(xue)活(huo)性(xing)不(bu)變。以固相載體(ti)上(shang)的(de)蛋白(bai)質(zhi)或(huo)多(duo)肽(tai)作為抗原，與對應的(de)抗體(ti)起(qi)免(mian)疫(yi)反應，再與酶或(huo)同(tong)位素標(biao)記的(de)第(di)二抗體(ti)起(qi)反應，經過底物顯(xian)色或(huo)放(fang)射自(zi)顯(xian)影以檢測(ce)電(dian)泳分(fen)離的(de)特(te)異(yi)性目的(de)基(ji)因(yin)表(biao)達的(de)蛋白(bai)成(cheng)分(fen)。該(gai)技(ji)術也(ye)廣(guang)泛應用(yong)於檢(jian)測(ce)蛋白(bai)水平的(de)表(biao)達。

二(er)、分(fen)類P6 免(mian)疫(yi)組(zu)化檢測(ce)試劑盒  現常用(yong)的(de)有(you)底(di)物(wu)化學(xue)發(fa)光(guang)ECL和底(di)物(wu)DAB呈色，體(ti)同(tong)水(shui)平和實(shi)驗(yan)條(tiao)件(jian)的(de)是用(yong)*種方(fang)法，目前(qian)發(fa)表(biao)文(wen)章通(tong)常是用(yong)底物(wu)化學(xue)發(fa)光(guang)ECL。只要買現成(cheng)的(de)試劑(ji)盒就行(xing)，操作也(ye)比(bi)較簡單(dan)，原理(li)如(ru)下(xia)（二(er)抗用(yong)HRP標(biao)記）：反應底物為過氧(yang)化物+魯(lu)米(mi)諾，如遇到(dao)HRP，即(ji)發(fa)光(guang)，可使膠片曝光(guang)，就可洗(xi)出(chu)條(tiao)帶(dai)。

三(san)、 主要試(shi)劑(ji)

、 丙烯酰(xian)胺(an)和N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙烯酰(xian)胺(an)，應以溫熱(re)（以利於溶(rong)解雙丙稀(xi)酰(xian)胺(an)）的(de)去離子(zi)水(shui)配制含有(you)29%（w/v）丙稀(xi)酰(xian)胺(an)和%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙烯酰(xian)胺(an)儲存(cun)液丙稀(xi)酰(xian)胺(an)29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉雙丙稀(xi)酰(xian)胺(an)g，加H2O至(zhi) 00ml。）儲於棕色(se)瓶，4℃避(bi)光(guang)保(bao)存(cun)。嚴(yan)格(ge)核實PH不(bu)得(de)超(chao)過7.0，因(yin)可以發(fa)生脫(tuo)氨基(ji)反應是光催化或(huo)堿(jian)催化的(de)。使用(yong)期(qi)不(bu)得(de)超(chao)過兩個月，隔幾個月(yue)須(xu)重(zhong)新(xin)配制(zhi)。如(ru)有(you)沈(chen)澱(dian)，可以過濾。     H,M,R 2、 十(shi)二(er)烷(wan)基(ji)硫(liu)#鈉(na)SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離子(zi)水(shui)配制，室溫(wen)保(bao)存(cun)。

3、 分(fen)離膠(jiao)緩沖液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混(hun)合(he)，加水稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終(zhong)體(ti)積(ji)。過濾後40℃保(bao)存(cun)。

4、 濃縮(suo)膠(jiao)緩沖液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於40mlH2O中，用(yong)約48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加水稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終(zhong)體(ti)積(ji)。過濾後40C保(bao)存(cun)。這(zhe)兩(liang)種(zhong)緩沖液必須使用(yong)Tris堿(jian)制(zhi)備，再用(yong)HCL調(tiao)節PH值，而(er)不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四(si)甲(jia)基(ji)乙二(er)胺(an)催化過硫#銨(an)形(xing)成(cheng)自(zi)由(you)基(ji)而(er)加速兩(liang)種丙稀(xi)酰(xian)胺(an)的(de)聚合(he)。PH太(tai)低(di)時(shi)，聚合(he)反應受(shou)到(dao)抑制。0%（w/v）過硫#胺(an)溶液(ye)。提供(gong)兩種丙稀(xi)酰(xian)胺(an)聚合(he)所(suo)必(bi)須(xu)的(de)自(zi)由(you)基(ji)。去(qu)離子(zi)水(shui)配制數ml，臨用(yong)前配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基(ji)乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍(lan).6ml，H2O 32ml混(hun)勻備(bei)用(yong)。按:或(huo):2比(bi)例(li)與(yu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣品混(hun)合(he)，在(zai)沸(fei)水終煮3min混(hun)勻後再上(shang)樣，壹(yi)般為20-25ul，總(zong)蛋(dan)白(bai)量(liang)00μg。

7、 Tris-甘氨(an)#電(dian)泳緩沖液:30.3gTris，88g甘氨(an)#，0gSDS，用(yong)蒸餾水溶解(jie)至(zhi)000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨(an)#電(dian)極(ji)緩沖液。臨用(yong)前稀(xi)釋(shi)0倍(bei)。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩沖液：配制L轉(zhuan)移(yi)緩沖液，需(xu)稱取2.9g甘氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並加入(ru)200ml甲(jia)醇，加水至(zhi)總(zong)量(liang)L。

9、 麗(li)春紅染(ran)液(ye)儲存(cun)液：麗(li)春紅S 2g 三(san)#乙#30g 磺(huang)基(ji)水(shui)楊# 30g 加水至(zhi)00ml 用(yong)時(shi)上(shang)述(shu)儲存(cun)液稀(xi)釋(shi)0倍(bei)即(ji)成(cheng)麗(li)春紅S使用(yong)液。使用(yong)後應予以廢棄。

0、 脫(tuo)脂奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮(dan)鈉（有(you)毒，戴手(shou)套(tao)操作），溶(rong)於磷(lin)#緩沖鹽溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖鹽溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗人-MMP-9（6）鼠(shu)抗人-TIMP-。

4、 過氧(yang)化物酶標(biao)記的(de)第(di)二抗體(ti)。

5、 NBT（溶(rong)於70%二(er)甲(jia)基(ji)甲(jia)酰(xian)胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於00%二(er)甲(jia)基(ji)甲(jia)酰(xian)胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。（可以參看分(fen)子(zi)克(ke)隆(long)）  做(zuo)線(xian)粒(li)體(ti)膜UCP2蛋白(bai)的(de)Western Blot （以下簡寫(xie)成(cheng)Western Blot），提(ti)取線(xian)粒(li)體(ti)後凍存(cun)（未加蛋白(bai)酶抑制劑），樣品不(bu)能反復凍融(rong);，加蛋白(bai)酶抑制劑。同時(shi)，建議(yi)檢查Western Blot過程， 提高壹抗濃度。對(dui)於加蛋白(bai)酶抑制劑來說(shuo)，壹般加PMSF就可以了(le)，能多(duo)加幾中種(zhong)蛋白(bai)酶抑制劑。
同壹(yi)蛋白(bai)樣品能同時(shi)進行兩(liang)種因(yin)子(zi)的(de)Western Blot檢測(ce)，有(you)的(de)甚至(zhi)可以同時(shi)測(ce)幾十種(zhong)樣品。
如果(guo)是膜蛋白(bai)和胞(bao)漿蛋(dan)白(bai)，所用(yong)的(de)去垢(gou)劑就要溫(wen)和得(de)多(duo)，這(zhe)時(shi)加上(shang)NaF去(qu)抑制磷#化酶的(de)活(huo)性(xing)。
樣品的(de)蛋白(bai)含量(liang)很低，每微升不(bu)到(dao)微克(ke)，但是在(zai)轉(zhuan)膜時(shi)經常會發(fa)現只有(you)壹(yi)部分(fen)蛋(dan)白(bai)轉到(dao)了(le)膜上(shang)，就(jiu)是在(zai)轉(zhuan)膜後染(ran)膠(jiao)發(fa)現有(you)的(de)孔所(suo)有(you)的(de)蛋白(bai)條(tiao)帶(dai)都在(zai)，只是顏色變淡了(le)，可以加大上(shang)樣量(liang)，轉(zhuan)移(yi)時(shi)可以用(yong)減少(shao)電(dian)流延長(chang)時(shi)間，多(duo)加5-0%甲醇。
想分(fen)離的(de)蛋白(bai)是分(fen)子(zi)量(liang)260kd的(de)，SDS-PAGE電(dian)泳的(de)分(fen)離膠(jiao)濃度用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的(de)蛋白(bai)不(bu)好做
如(ru)果上(shang)樣量(liang)超(chao)載，可以濃縮(suo)樣品，也(ye)可以根據(ju)妳的(de)目標(biao)分(fen)子(zi)量(liang)透(tou)析掉(diao)壹部分(fen)小(xiao)分(fen)子(zi)蛋(dan)白(bai)。壹般地(di)，超(chao)載30%是不(bu)會有(you)問(wen)題的(de)。如果(guo)已經(jing)超(chao)了(le)不(bu)少(shao)了(le)，而(er)且小(xiao)分(fen)子(zi)量(liang)的(de)也(ye)要，可以考慮加大膠(jiao)的(de)厚(hou)度，可以試試.5mm的(de) comb。
蛋白(bai)變性後存(cun)放-80℃，壹兩(liang)年(nian)沒有(you)問(wen)題，zui關(guan)鍵(jian)兩(liang)條(tiao)：不(bu)要被(bei)蛋(dan)白(bai)酶水解(jie)掉(diao);不(bu)要被(bei)細(xi)菌(jun)消化掉（也(ye)是被(bei)酶水解(jie)了(le)）。
采(cai)用(yong)DAB顯(xian)色技(ji)術，二(er)抗是化的(de)多(duo)克(ke)隆(long)抗體(ti)，三(san)抗是親和素體(ti)系(xi)，不(bu)能使用(yong)脫(tuo)脂奶粉，脫(tuo)脂奶粉會影響(xiang)親和素的(de)生成(cheng)，因(yin)為脫(tuo)脂奶粉中含(han)，用(yong)BSA代(dai)替應該好壹點(dian).
Western Blot壹般上(shang)樣30-00微(wei)克(ke)不(bu)等，結果(guo)跟(gen)目的(de)蛋白(bai)的(de)豐(feng)度、上(shang)樣量(liang)、壹(yi)二抗的(de)量(liang)和撫(fu)育時(shi)間都有(you)關(guan)系，也(ye)與(yu)顯(xian)色時(shi)間長短(duan)有(you)關(guan)。開始(shi)摸(mo)條(tiao)件(jian)時(shi)，為了(le)拿(na)到(dao)陽(yang)性(xing)結果(guo)，各個步驟都可以量(liang)多(duo)壹(yi)點時(shi)間長壹(yi)點，當然背景也(ye)就(jiu)出(chu)來了(le)。要拿(na)到(dao)好的(de)結果(guo)，如(ru)果抗體(ti)好的(de)話比(bi)較(jiao)容易，抗體(ti)不(bu)好的(de)話就(jiu)需(xu)要反復地(di)試了(le)，當然有(you)的(de)不(bu)適合(he)Western Blot的(de)怎樣做(zuo)也(ye)不(bu)行。所(suo)以拿(na)到(dao)好的(de)結果(guo)不(bu)容易。