【概(gai)要描(miao)述(shu)】鼠(shu)抗(kang)人(ren)α橫(heng)紋肌(ji)肌動蛋(dan)白(bai)單(dan)克(ke)隆抗(kang)體(ti) Actin（Alpha-Sarcomeric） Western Blot)是(shi)將(jiang)蛋白質(zhi)轉移(yi)到膜(mo)上(shang)，然(ran)後(hou)利(li)用抗(kang)體(ti)進(jin)行(xing)檢測(ce)。

鼠抗(kang)人(ren)α橫(heng)紋肌(ji)肌動蛋(dan)白(bai)單(dan)克(ke)隆抗(kang)體(ti) Actin（Alpha-Sarcomeric）   Western Blot技(ji)術(shu):

壹、 原理

與(yu)Southern或(huo)Northern雜(za)交方法(fa)類似(si)，但(dan)Western Blot采(cai)用的(de)是(shi)聚(ju)丙(bing)烯酰胺凝膠電(dian)泳(yong)，被檢測(ce)物(wu)是(shi)蛋(dan)白(bai)質(zhi)，“探(tan)針”是(shi)抗(kang)體(ti)，“顯(xian)色”用(yong)標記(ji)的(de)二抗(kang)。經過(guo)PAGE分離(li)的蛋(dan)白質(zhi)樣品(pin)，轉移(yi)到固(gu)相載(zai)體(ti)（例(li)如(ru)硝#纖維素薄(bo)膜）上(shang)，固(gu)相載(zai)體(ti)以(yi)非(fei)共價(jia)鍵形式吸附蛋白(bai)質(zhi)，且(qie)能保持(chi)電(dian)泳(yong)分離(li)的多(duo)肽類型及其生(sheng)物(wu)學活(huo)性不變(bian)。以(yi)固(gu)相載(zai)體(ti)上(shang)的蛋白(bai)質(zhi)或(huo)多肽作為(wei)抗(kang)原(yuan)，與(yu)對應(ying)的(de)抗(kang)體(ti)起免(mian)疫(yi)反(fan)應(ying)，再與(yu)酶或(huo)同位素標記(ji)的(de)第(di)二(er)抗(kang)體(ti)起反(fan)應(ying)，經過(guo)底(di)物(wu)顯(xian)色或放(fang)射(she)自(zi)顯(xian)影以(yi)檢測(ce)電(dian)泳(yong)分離(li)的特(te)異(yi)性目(mu)的基(ji)因表(biao)達(da)的蛋白成分。該技(ji)術(shu)也廣泛應(ying)用(yong)於(yu)檢測(ce)蛋(dan)白水平的表(biao)達(da)。

二、分類(lei) 鼠抗(kang)人(ren)α橫(heng)紋肌(ji)肌動蛋(dan)白(bai)單(dan)克(ke)隆抗(kang)體(ti) Actin（Alpha-Sarcomeric）   現(xian)常用的有(you)底(di)物(wu)化學(xue)發(fa)光(guang)ECL和(he)底(di)物(wu)DAB呈(cheng)色，體(ti)同(tong)水平和實驗條件的是(shi)用(yong)*種(zhong)方法(fa)，目(mu)前(qian)發表(biao)文(wen)章通(tong)常是(shi)用(yong)底(di)物(wu)化學(xue)發(fa)光(guang)ECL。只(zhi)要買(mai)現成(cheng)的(de)試(shi)劑盒(he)就(jiu)行(xing)，操作(zuo)也比(bi)較簡單(dan)，原(yuan)理如(ru)下（二(er)抗(kang)用(yong)HRP標記(ji)）：反(fan)應(ying)底(di)物(wu)為過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)+魯米(mi)諾，如(ru)遇到HRP，即(ji)發光(guang)，可使膠片曝光(guang)，就(jiu)可洗出(chu)條帶。

三、 主(zhu)要(yao)試劑

、 丙(bing)烯酰胺和N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙烯酰胺，應(ying)以(yi)溫(wen)熱(re)（以(yi)利(li)於溶(rong)解雙丙稀(xi)酰(xian)胺）的(de)去離(li)子(zi)水配制含(han)有(you)29%（w/v）丙(bing)稀酰胺(an)和(he)%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙烯酰胺儲存液(ye)丙(bing)稀(xi)酰胺(an)29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉雙丙稀(xi)酰(xian)胺g，加(jia)H2O至(zhi) 00ml。）儲(chu)於棕色瓶，4℃避光(guang)保(bao)存(cun)。嚴(yan)格核實(shi)PH不得(de)超(chao)過(guo)7.0，因(yin)可以(yi)發(fa)生(sheng)脫(tuo)氨基(ji)反(fan)應(ying)是(shi)光(guang)催(cui)化(hua)或堿(jian)催(cui)化(hua)的。使用期(qi)不得(de)超(chao)過(guo)兩(liang)個月，隔(ge)幾(ji)個月須重(zhong)新(xin)配(pei)制(zhi)。如(ru)有沈(chen)澱(dian)，可以(yi)過(guo)濾(lv) 鼠抗(kang)人(ren)α橫(heng)紋肌(ji)肌動蛋(dan)白(bai)單(dan)克(ke)隆抗(kang)體(ti) Actin（Alpha-Sarcomeric）   ） 
2、 十二(er)烷(wan)基(ji)硫#鈉(na)SDS溶(rong)液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子(zi)水配制，室溫保存。

3、 分離(li)膠緩沖(chong)液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混(hun)合，加水稀釋(shi)到00ml終體(ti)積(ji)。過濾(lv)後40℃保(bao)存。

4、 濃(nong)縮膠緩沖(chong)液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於40mlH2O中(zhong)，用約48ml mol/L HCl調至(zhi)pH6.8加(jia)水稀釋(shi)到00ml終體(ti)積(ji)。過濾(lv)後40C保(bao)存。這(zhe)兩(liang)種(zhong)緩沖(chong)液(ye)必(bi)須使用Tris堿(jian)制備(bei)，再用(yong)HCL調節(jie)PH值，而不用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液N，N，N’N’四甲(jia)基乙(yi)二胺(an)催化(hua)過(guo)硫#銨(an)形成(cheng)自(zi)由基(ji)而(er)加(jia)速兩(liang)種(zhong)丙稀(xi)酰(xian)胺(an)的聚合(he)。PH太(tai)低(di)時(shi)，聚(ju)合反(fan)應(ying)受到抑(yi)制(zhi)。0%（w/v）過(guo)硫#胺(an)溶(rong)液。提(ti)供(gong)兩(liang)種(zhong)丙稀(xi)酰(xian)胺(an)聚合所(suo)必(bi)須的(de)自(zi)由基(ji)。去(qu)離(li)子(zi)水配制數ml，臨用前(qian)配制(zhi).

6、 SDS- PAGE加(jia)樣緩(huan)沖(chong)液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖(chong)液(ye)8ml，甘(gan)油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基乙醇(chun)3.2ml，0.05%溴(xiu)酚(fen)藍.6ml，H2O 32ml混(hun)勻備(bei)用。按:或(huo):2比(bi)例(li)與(yu)蛋白(bai)質(zhi)樣品(pin)混(hun)合(he)，在沸(fei)水終煮(zhu)3min混(hun)勻後再上(shang)樣，壹(yi)般為(wei)20-25ul，總(zong)蛋白量(liang)00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨(an)#電(dian)泳(yong)緩沖(chong)液(ye):30.3gTris，88g甘(gan)氨(an)#，0gSDS，用(yong)蒸餾水溶(rong)解至000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨(an)#電(dian)極緩(huan)沖(chong)液(ye)。臨用前(qian)稀釋(shi)0倍(bei)。

8、 轉移(yi)緩沖(chong)液(ye)：配(pei)制(zhi)L轉移(yi)緩沖(chong)液(ye)，需稱取2.9g甘(gan)氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並加入(ru)200ml甲(jia)醇，加(jia)水至總量L。

9、 麗(li)春紅(hong)染液(ye)儲(chu)存液(ye)：麗(li)春紅(hong)S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺(huang)基水楊(yang)# 30g 加(jia)水至00ml 用(yong)時上(shang)述(shu)儲(chu)存(cun)液(ye)稀釋(shi)0倍(bei)即(ji)成麗(li)春紅(hong)S使用液(ye)。使用後(hou)應(ying)予以(yi)廢棄(qi)。

0、 脫(tuo)脂奶(nai)粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉（有(you)毒(du)，戴(dai)手套操作(zuo)），溶(rong)於磷(lin)#緩(huan)沖(chong)鹽(yan)溶(rong)液（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖(chong)鹽(yan)溶(rong)液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗(kang)人(ren)-MMP-9（6）鼠(shu)抗(kang)人(ren)-TIMP-。

4、 過(guo)氧化物(wu)酶標記(ji)的(de)第(di)二(er)抗(kang)體(ti)。

5、 NBT（溶(rong)於70%二(er)甲(jia)基甲(jia)酰胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於00%二(er)甲(jia)基甲(jia)酰胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA 鼠(shu)抗(kang)人(ren)α橫(heng)紋肌(ji)肌動蛋(dan)白(bai)單(dan)克(ke)隆抗(kang)體(ti) Actin（Alpha-Sarcomeric）   做(zuo)線(xian)粒(li)體(ti)膜(mo)UCP2蛋白的(de)Western Blot （以(yi)下(xia)簡寫(xie)成Western Blot），提取(qu)線(xian)粒(li)體(ti)後(hou)凍存(cun)（未加(jia)蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑），樣品(pin)不能反(fan)復(fu)凍融(rong);，加(jia)蛋白酶抑(yi)制(zhi)劑。同(tong)時(shi)，建議檢查Western Blot過(guo)程(cheng)， 提(ti)高壹抗(kang)濃(nong)度。對於加(jia)蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑來(lai)說，壹(yi)般加(jia)PMSF就可以(yi)了(le)，能多加(jia)幾(ji)中種(zhong)蛋白(bai)酶(mei)抑(yi)制劑。
同(tong)壹(yi)蛋(dan)白樣品(pin)能同時(shi)進(jin)行(xing)兩(liang)種(zhong)因子(zi)的(de)Western Blot檢測(ce)，有(you)的甚至可以(yi)同(tong)時(shi)測(ce)幾十種(zhong)樣品(pin)。
如(ru)果是(shi)膜(mo)蛋(dan)白(bai)和(he)胞漿(jiang)蛋白，所(suo)用的(de)去(qu)垢(gou)劑就(jiu)要(yao)溫(wen)和得(de)多(duo)，這(zhe)時(shi)加(jia)上(shang)NaF去抑制(zhi)磷(lin)#化酶(mei)的(de)活性。
樣品(pin)的(de)蛋(dan)白含(han)量(liang)很(hen)低(di)，每微升不到微(wei)克(ke)，但是(shi)在轉膜時經常會發現(xian)只有壹部分蛋(dan)白轉到了(le)膜(mo)上(shang)，就是(shi)在轉膜後染膠發現有(you)的(de)孔(kong)所(suo)有的蛋白條帶都在，只是(shi)顏色變(bian)淡了，可以(yi)加(jia)大(da)上(shang)樣量(liang)，轉移(yi)時可以(yi)用(yong)減(jian)少(shao)電(dian)流延(yan)長時(shi)間(jian)，多加(jia)5-0%甲(jia)醇。
想(xiang)分離(li)的蛋(dan)白是(shi)分子(zi)量(liang)260kd的，SDS-PAGE電(dian)泳(yong)的分離(li)膠濃度用6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的(de)蛋(dan)白(bai)不好(hao)做
如(ru)果上(shang)樣量(liang)超(chao)載(zai)，可以(yi)濃(nong)縮樣品(pin)，也可以(yi)根(gen)據妳(ni)的目(mu)標分子(zi)量(liang)透(tou)析掉壹部分小(xiao)分子(zi)蛋(dan)白。壹般地，超載(zai)30%是(shi)不會(hui)有(you)問(wen)題的(de)。如(ru)果已經超(chao)了(le)不少(shao)了(le)，而(er)且小(xiao)分子(zi)量(liang)的也要(yao)，可以(yi)考(kao)慮(lv)加(jia)大(da)膠的厚(hou)度，可以(yi)試(shi)試(shi).5mm的(de) comb。
蛋白變(bian)性後存(cun)放-80℃，壹兩(liang)年沒有問(wen)題，zui關(guan)鍵兩(liang)條：不要(yao)被(bei)蛋(dan)白酶(mei)水解掉;不要(yao)被(bei)細菌(jun)消(xiao)化掉（也是(shi)被(bei)酶(mei)水解了）。
采(cai)用DAB顯(xian)色技(ji)術(shu)，二抗(kang)是(shi)化(hua)的(de)多(duo)克(ke)隆抗(kang)體(ti)，三(san)抗(kang)是(shi)親(qin)和素體(ti)系，不能使用脫(tuo)脂奶(nai)粉，脫(tuo)脂奶(nai)粉會(hui)影響(xiang)親(qin)和素的(de)生(sheng)成(cheng)，因為(wei)脫脂奶(nai)粉中(zhong)含(han)，用(yong)BSA代(dai)替(ti)應(ying)該好(hao)壹點.
Western Blot壹(yi)般上(shang)樣30-00微(wei)克(ke)不等(deng)，結(jie)果跟目(mu)的蛋(dan)白的豐度、上(shang)樣量(liang)、壹(yi)二(er)抗(kang)的(de)量和撫(fu)育時間都有(you)關(guan)系，也與(yu)顯(xian)色時間(jian)長短(duan)有(you)關。開(kai)始(shi)摸條件時，為(wei)了(le)拿到陽(yang)性結(jie)果，各個步(bu)驟都可以(yi)量(liang)多(duo)壹(yi)點時(shi)間長壹(yi)點，當(dang)然(ran)背(bei)景(jing)也就(jiu)出(chu)來(lai)了。要(yao)拿到好(hao)的結(jie)果，如(ru)果抗(kang)體(ti)好(hao)的話比(bi)較容(rong)易，抗(kang)體(ti)不好(hao)的話就(jiu)需要反(fan)復(fu)地試了，當(dang)然(ran)有(you)的(de)不適合Western Blot的(de)怎樣做(zuo)也不行(xing)。所以(yi)拿到好(hao)的結(jie)果不容(rong)易。