【概(gai)要描述】鼠(shu)抗人(ren)橫(heng)紋(wen)肌肌動蛋(dan)白(bai)單(dan)克隆(long)抗體(ti) Actin（Sarcomeric） Western免(mian)疫(yi)印跡(Western Blot)是將蛋(dan)白(bai)質轉(zhuan)移(yi)到(dao)膜(mo)上(shang)，然後(hou)利(li)用(yong)抗體(ti)進(jin)行檢測(ce)。

鼠(shu)抗人(ren)橫(heng)紋(wen)肌肌動蛋(dan)白(bai)單(dan)克隆(long)抗體(ti) Actin（Sarcomeric）Western Blot技(ji)術: 做線粒(li)體(ti)膜(mo)UCP2蛋(dan)白(bai)的Western Blot （以(yi)下簡(jian)寫(xie)成(cheng)Western Blot），提(ti)取(qu)線粒(li)體(ti)後(hou)凍存（未(wei)加(jia)蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制劑(ji)），樣品(pin)不能(neng)反(fan)復凍融(rong);，加(jia)蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制劑(ji)。同時(shi)，建(jian)議(yi)檢查Western Blot過(guo)程， 提(ti)高壹抗濃度(du)。對於(yu)加(jia)蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制劑(ji)來說(shuo)，壹般加(jia)PMSF就(jiu)可(ke)以(yi)了，能(neng)多(duo)加(jia)幾(ji)中(zhong)種(zhong)蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制劑(ji)。
同壹蛋(dan)白(bai)樣品(pin)能同時(shi)進(jin)行兩(liang)種(zhong)因(yin)子(zi)的(de)Western Blot檢測(ce)，有(you)的甚(shen)至(zhi)可(ke)以(yi)同時(shi)測(ce)幾十(shi)種(zhong)樣 鼠(shu)抗人(ren)橫(heng)紋(wen)肌肌動蛋(dan)白(bai)單(dan)克隆(long)抗體(ti) Actin（Sarcomeric） 如(ru)果是膜(mo)蛋(dan)白(bai)和(he)胞(bao)漿蛋(dan)白(bai)，所(suo)用(yong)的去垢(gou)劑就(jiu)要溫和(he)得多(duo)，這時(shi)加(jia)上(shang)NaF去(qu)抑(yi)制磷(lin)#化(hua)酶(mei)的(de)活(huo)性。
樣品(pin)的蛋(dan)白(bai)含量(liang)很(hen)低(di)，每(mei)微(wei)升(sheng)不到(dao)微(wei)克，但(dan)是在轉(zhuan)膜(mo)時(shi)經(jing)常(chang)會發(fa)現(xian)只(zhi)有(you)壹部(bu)分(fen)蛋(dan)白(bai)轉(zhuan)到(dao)了(le)膜(mo)上(shang)，就是在轉(zhuan)膜(mo)後(hou)染膠(jiao)發(fa)現有(you)的孔(kong)所(suo)有(you)的蛋(dan)白(bai)條(tiao)帶都(dou)在，只(zhi)是顏色(se)變(bian)淡(dan)了，可以(yi)加(jia)大(da)上(shang)樣量(liang)，轉(zhuan)移(yi)時(shi)可以(yi)用(yong)減(jian)少(shao)電流(liu)延(yan)長(chang)時(shi)間，多(duo)加(jia)5-0%甲(jia)醇(chun)。
想(xiang)分(fen)離(li)的(de)蛋(dan)白(bai)是分(fen)子(zi)量(liang)260kd的(de)，SDS-PAGE電(dian)泳(yong)的分(fen)離(li)膠(jiao)濃度(du)用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的蛋(dan)白(bai)不好做
如(ru)果上(shang)樣量(liang)超載(zai)，可(ke)以(yi)濃縮(suo)樣品(pin)，也可以(yi)根據妳的(de)目(mu)標(biao)分(fen)子(zi)量(liang)透(tou)析(xi)掉壹部(bu)分(fen)小分(fen)子(zi)蛋(dan)白(bai)。壹般地(di)，超載(zai)30%是不會有(you)問(wen)題的(de)。如(ru)果已(yi)經(jing)超了(le)不少(shao)了，而(er)且小分(fen)子(zi)量(liang)的(de)也(ye)要，可以(yi)考慮(lv)加(jia)大(da)膠(jiao)的(de)厚(hou)度(du)，可以(yi)試(shi)試(shi).5mm的 comb。
蛋(dan)白(bai)變性(xing)後(hou)存(cun)放(fang)-80℃，壹兩(liang)年沒(mei)有(you)問(wen)題，zui關(guan)鍵(jian)兩(liang)條(tiao)：不要被(bei)蛋(dan)白(bai)酶水(shui)解(jie)掉(diao);不要被(bei)細菌消化(hua)掉(diao)（也(ye)是被(bei)酶(mei)水(shui)解(jie)了(le)）。
采用(yong)DAB顯色技(ji)術，二(er)抗是化(hua)的(de)多(duo)克隆(long)抗體(ti)，三抗是親(qin)和(he)素(su)體(ti)系(xi)，不能(neng)使(shi)用(yong)脫脂(zhi)奶粉，脫脂(zhi)奶粉會影(ying)響(xiang)親(qin)和(he)素(su)的生(sheng)成(cheng)，因為(wei)脫脂(zhi)奶粉中(zhong)含，用(yong)BSA代替應(ying)該好壹點(dian). 鼠(shu)抗人(ren)橫(heng)紋(wen)肌肌動蛋(dan)白(bai)單(dan)克隆(long)抗體(ti) Actin（Sarcomeric） Western Blot壹般上樣30-00微(wei)克不等，結(jie)果跟(gen)目(mu)的(de)蛋(dan)白(bai)的豐度(du)、上樣量(liang)、壹二(er)抗的量(liang)和(he)撫(fu)育時(shi)間都(dou)有(you)關(guan)系，也(ye)與(yu)顯(xian)色時(shi)間長(chang)短(duan)有(you)關(guan)。開始摸(mo)條(tiao)件時(shi)，為(wei)了(le)拿(na)到(dao)陽(yang)性(xing)結(jie)果，各(ge)個(ge)步驟(zhou)都可(ke)以(yi)量(liang)多(duo)壹點(dian)時(shi)間長(chang)壹點(dian)，當(dang)然(ran)背(bei)景也就(jiu)出(chu)來了。要拿到(dao)好的結(jie)果，如(ru)果抗體(ti)好的話比(bi)較(jiao)容(rong)易，抗體(ti)不好的話就需(xu)要反復地(di)試(shi)了，當(dang)然有(you)的不適(shi)合(he)Western Blot的(de)怎樣做也不行。所(suo)以(yi)拿到(dao)好的結(jie)果不容(rong)易。

 鼠(shu)抗人(ren)橫(heng)紋(wen)肌肌動蛋(dan)白(bai)單(dan)克隆(long)抗體(ti) Actin（Sarcomeric）壹、 原(yuan)理(li)

與Southern或(huo)Northern雜交(jiao)方法類似，但(dan)Western Blot采用(yong)的是聚丙(bing)烯酰(xian)胺(an)凝(ning)膠電(dian)泳(yong)，被(bei)檢測(ce)物是蛋(dan)白(bai)質，“探(tan)針(zhen)”是抗體(ti)，“顯(xian)色(se)”用(yong)標(biao)記的(de)二(er)抗。經(jing)過PAGE分(fen)離(li)的(de)蛋(dan)白(bai)質樣品(pin)，轉(zhuan)移(yi)到(dao)固(gu)相載(zai)體(ti)（例(li)如(ru)硝#纖(xian)維(wei)素薄膜(mo)）上(shang)，固(gu)相載(zai)體(ti)以(yi)非共價鍵(jian)形(xing)式吸(xi)附(fu)蛋(dan)白(bai)質，且(qie)能(neng)保(bao)持電泳(yong)分(fen)離(li)的(de)多(duo)肽類型及其(qi)生(sheng)物學活性不變(bian)。以(yi)固(gu)相載(zai)體(ti)上(shang)的(de)蛋(dan)白(bai)質或(huo)多(duo)肽作(zuo)為(wei)抗原，與對(dui)應的(de)抗體(ti)起(qi)免(mian)疫(yi)反(fan)應，再(zai)與(yu)酶(mei)或同(tong)位素(su)標(biao)記的(de)第(di)二(er)抗體(ti)起(qi)反(fan)應，經(jing)過底(di)物顯(xian)色(se)或放(fang)射(she)自顯(xian)影(ying)以(yi)檢測(ce)電泳(yong)分(fen)離(li)的(de)特異性目(mu)的(de)基因表(biao)達(da)的(de)蛋(dan)白(bai)成分(fen)。該技(ji)術也廣泛應(ying)用(yong)於(yu)檢測(ce)蛋(dan)白(bai)水平(ping)的(de)表(biao)達(da)。

二(er)、分(fen)類  現常(chang)用(yong)的有(you)底物化(hua)學發光ECL和(he)底(di)物DAB呈(cheng)色(se)，體(ti)同(tong)水(shui)平(ping)和(he)實(shi)驗(yan)條(tiao)件的是用(yong)*種(zhong)方法，目(mu)前(qian)發(fa)表(biao)文(wen)章通(tong)常(chang)是用(yong)底物化(hua)學發光ECL。只(zhi)要買(mai)現成的試(shi)劑盒(he)就(jiu)行，操(cao)作(zuo)也比(bi)較(jiao)簡(jian)單(dan)，原理如(ru)下（二(er)抗用(yong)HRP標(biao)記）：反(fan)應(ying)底物為(wei)過(guo)氧(yang)化(hua)物+魯(lu)米(mi)諾，如(ru)遇到(dao)HRP，即(ji)發光，可使(shi)膠(jiao)片曝(pu)光，就可(ke)洗(xi)出(chu)條(tiao)帶。

三、 主要試(shi)劑

、 丙(bing)烯酰(xian)胺(an)和(he)N，N’-亞甲(jia)雙丙(bing)烯酰(xian)胺(an)，應以(yi)溫熱（以(yi)利於(yu)溶(rong)解雙丙(bing)稀(xi)酰胺(an)）的(de)去(qu)離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制含有(you)29%（w/v）丙(bing)稀(xi)酰胺(an)和(he)%（w/v）N，N’-亞甲(jia)雙丙(bing)烯酰(xian)胺(an)儲(chu)存(cun)液丙(bing)稀(xi)酰胺(an)29g，N，N-亞甲(jia)叉雙(shuang)丙(bing)稀(xi)酰胺(an)g，加(jia)H2O至(zhi) 00ml。）儲(chu)於(yu)棕(zong)色(se)瓶(ping)，4℃避(bi)光保(bao)存。嚴格核(he)實(shi)PH不得超過(guo)7.0，因(yin)可(ke)以(yi)發生(sheng)脫氨基反應是光催化(hua)或(huo)堿催化(hua)的(de)。使(shi)用(yong)期不得超過(guo)兩(liang)個月(yue)，隔(ge)幾(ji)個(ge)月(yue)須重新配(pei)制。如(ru)有(you)沈澱(dian)，可(ke)以(yi)過濾。  2、 十(shi)二(er)烷基(ji)硫(liu)#鈉SDS溶(rong)液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制，室溫保(bao)存。

3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩沖液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混合(he)，加(jia)水(shui)稀(xi)釋到(dao)00ml終(zhong)體(ti)積(ji)。過濾後(hou)40℃保(bao)存。

4、 濃(nong)縮(suo)膠緩沖液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於(yu)40mlH2O中(zhong)，用(yong)約48ml mol/L HCl調至(zhi)pH6.8加(jia)水(shui)稀(xi)釋到(dao)00ml終(zhong)體(ti)積(ji)。過濾後(hou)40C保(bao)存。這兩(liang)種(zhong)緩沖液必須使(shi)用(yong)Tris堿制備(bei)，再用(yong)HCL調節(jie)PH值(zhi)，而(er)不用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液N，N，N’N’四甲(jia)基(ji)乙(yi)二(er)胺(an)催化(hua)過(guo)硫(liu)#銨(an)形(xing)成(cheng)自由(you)基而(er)加(jia)速(su)兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀(xi)酰胺(an)的聚合。PH太(tai)低(di)時(shi)，聚合反(fan)應(ying)受(shou)到(dao)抑(yi)制。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺(an)溶液。提供(gong)兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀(xi)酰胺(an)聚合所(suo)必須(xu)的自由(you)基。去(qu)離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制數(shu)ml，臨(lin)用(yong)前(qian)配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加(jia)樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘(gan)油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基(ji)乙(yi)醇(chun)3.2ml，0.05%溴酚(fen)藍(lan).6ml，H2O 32ml混勻(yun)備(bei)用(yong)。按(an):或(huo):2比(bi)例(li)與(yu)蛋(dan)白(bai)質樣品(pin)混合(he)，在沸(fei)水終(zhong)煮3min混勻(yun)後(hou)再(zai)上(shang)樣，壹般為(wei)20-25ul，總(zong)蛋(dan)白(bai)量(liang)00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨#電(dian)泳(yong)緩沖液:30.3gTris，88g甘(gan)氨#，0gSDS，用(yong)蒸餾水溶(rong)解(jie)至(zhi)000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨#電(dian)極(ji)緩沖液。臨用(yong)前(qian)稀(xi)釋0倍(bei)。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩沖液：配(pei)制L轉(zhuan)移(yi)緩沖液，需(xu)稱(cheng)取(qu)2.9g甘(gan)氨#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並加(jia)入(ru)200ml甲(jia)醇(chun)，加(jia)水(shui)至(zhi)總(zong)量(liang)L。

9、 麗(li)春(chun)紅染液儲(chu)存(cun)液：麗(li)春(chun)紅S 2g 三#乙(yi)#30g 磺(huang)基(ji)水楊(yang)# 30g 加(jia)水(shui)至(zhi)00ml 用(yong)時(shi)上述儲(chu)存(cun)液稀(xi)釋0倍(bei)即(ji)成麗(li)春(chun)紅S使(shi)用(yong)液。使(shi)用(yong)後(hou)應(ying)予(yu)以(yi)廢棄(qi)。

0、 脫脂(zhi)奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮(dan)鈉（有(you)毒(du)，戴手套操(cao)作(zuo)），溶(rong)於(yu)磷(lin)#緩沖鹽(yan)溶液（PBS）。

2、 Tris緩沖鹽(yan)溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗人(ren)-MMP-9（6）鼠(shu)抗人(ren)-TIMP-。

4、 過(guo)氧(yang)化(hua)物酶(mei)標(biao)記的(de)第(di)二(er)抗體(ti)。

5、 NBT（溶(rong)於(yu)70%二(er)甲基(ji)甲酰(xian)胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於(yu)00%二(er)甲基(ji)甲酰(xian)胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。