【概(gai)要(yao)描述】兔(tu)抗(kang)人溶(rong)菌素(su)多(duo)克(ke)隆(long)抗(kang)體 Lysozyme Western Blot)是(shi)將蛋白質(zhi)轉移(yi)到膜(mo)上(shang)，然(ran)後利(li)用(yong)抗(kang)體進(jin)行檢(jian)測(ce)。

兔抗(kang)人溶(rong)菌素(su)多(duo)克(ke)隆(long)抗(kang)體 Lysozyme   Western Blot技(ji)術(shu):

鼠抗(kang)人肌(ji)鈣蛋白C單(dan)克隆(long)抗(kang)體 Troponin C
LOP506 鼠抗(kang)人肌(ji)鈣蛋白T單(dan)克隆(long)抗(kang)體 Troponin T
LOP507 鼠抗(kang)人甲狀(zhuang)腺轉錄(lu)因(yin)子(zi)單克(ke)隆(long)抗(kang)體 TTF-
LOP508 鼠抗(kang)人微管(guan)蛋白α單(dan)克隆(long)抗(kang)體 Tubulin α
LOP509 鼠抗(kang)人微管(guan)蛋白β單(dan)克隆(long)抗(kang)體 Tubulin β
LOP50 鼠抗(kang)人腫瘤相(xiang)關糖蛋白單(dan)克隆(long)抗(kang)體 Tumor Associated lycoprotein（TAG-72）
LOP5 鼠抗(kang)人酶(mei)單克(ke)隆(long)抗(kang)體 Tyrosinase
兔(tu)抗(kang)人溶(rong)菌素(su)多(duo)克(ke)隆(long)抗(kang)體 Lysozyme  LOP52 鼠抗(kang)人Ubiquitin單克(ke)隆(long)抗(kang)體 Ubiquitin Antibodies 壹、 原理(li)

與(yu)Southern或Northern雜(za)交方(fang)法(fa)類似(si)，但Western Blot采(cai)用(yong)的(de)是(shi)聚丙(bing)烯酰胺凝膠(jiao)電(dian)泳(yong)，被檢(jian)測(ce)物是(shi)蛋白質(zhi)，“探針”是(shi)抗(kang)體，“顯(xian)色”用(yong)標記(ji)的(de)二抗(kang)。經(jing)過(guo)PAGE分(fen)離的(de)蛋白質(zhi)樣品(pin)，轉移(yi)到固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)（例(li)如硝(xiao)#纖維素(su)薄(bo)膜）上(shang)，固相(xiang)載(zai)體(ti)以(yi)非(fei)共價鍵(jian)形(xing)式吸(xi)附蛋白質(zhi)，且(qie)能(neng)保(bao)持電(dian)泳(yong)分離的(de)多肽類(lei)型及(ji)其生物(wu)學活性(xing)不變(bian)。以(yi)固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)上(shang)的(de)蛋白質(zhi)或多肽(tai)作為(wei)抗(kang)原，與(yu)對應的(de)抗(kang)體起(qi)免疫反(fan)應，再與(yu)酶(mei)或同(tong)位(wei)素(su)標(biao)記(ji)的(de)第(di)二(er)抗(kang)體起(qi)反(fan)應，經(jing)過(guo)底(di)物(wu)顯色或放射(she)自顯影(ying)以(yi)檢(jian)測(ce)電(dian)泳(yong)分離的(de)特(te)異(yi)性(xing)目的(de)基因(yin)表達(da)的(de)蛋白成(cheng)分。該技(ji)術(shu)也廣(guang)泛應用(yong)於檢(jian)測(ce)蛋白水(shui)平(ping)的(de)表達(da)。

二(er)、分(fen)類(lei) Lysozyme 現(xian)常(chang)用(yong)的(de)有(you)底(di)物化(hua)學發光ECL和(he)底物(wu)DAB呈(cheng)色，體同(tong)水平(ping)和(he)實(shi)驗(yan)條件(jian)的(de)是(shi)用(yong)*種(zhong)方(fang)法(fa)，目前發表文章通常(chang)是(shi)用(yong)底物(wu)化(hua)學發光ECL。只(zhi)要(yao)買(mai)現(xian)成的(de)試劑(ji)盒就(jiu)行，操(cao)作也比(bi)較簡(jian)單，原理(li)如下(xia)（二(er)抗(kang)用(yong)HRP標(biao)記）：反(fan)應底物(wu)為(wei)過氧化(hua)物(wu)+魯(lu)米諾，如遇到HRP，即(ji)發光，可(ke)使(shi)膠(jiao)片曝光，就可(ke)洗(xi)出條帶。

三(san)、 主要(yao)試劑(ji)

、 丙(bing)烯酰胺和(he)N，N’-亞甲(jia)雙丙(bing)烯酰胺，應以(yi)溫(wen)熱（以(yi)利(li)於溶(rong)解雙丙(bing)稀酰胺）的(de)去(qu)離子(zi)水配制含(han)有(you)29%（w/v）丙(bing)稀酰胺和(he)%（w/v）N，N’-亞甲(jia)雙丙(bing)烯酰胺儲(chu)存液(ye)丙(bing)稀酰胺29g，N，N-亞甲(jia)叉(cha)雙丙(bing)稀酰胺g，加H2O至 00ml。）儲(chu)於棕色瓶(ping)，4℃避(bi)光保(bao)存。嚴(yan)格核實(shi)PH不得超(chao)過7.0，因(yin)可(ke)以(yi)發生脫氨基反(fan)應是(shi)光催(cui)化(hua)或堿催(cui)化(hua)的(de)。使用(yong)期(qi)不得超(chao)過兩個月(yue)，隔(ge)幾(ji)個月(yue)須(xu)重新配制。如(ru)有(you)沈(chen)澱，可(ke)以(yi)過(guo)濾(lv)。 Lysozyme 2、 十二(er)烷(wan)基硫#鈉(na)SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離子(zi)水配制，室(shi)溫(wen)保(bao)存。

3、 分(fen)離膠(jiao)緩沖(chong)液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混(hun)合(he)，加水(shui)稀(xi)釋到00ml終(zhong)體積。過濾(lv)後(hou)40℃保(bao)存。

4、 濃(nong)縮膠(jiao)緩沖(chong)液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於40mlH2O中(zhong)，用(yong)約48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加水(shui)稀(xi)釋到00ml終(zhong)體積。過濾(lv)後(hou)40C保(bao)存。這兩(liang)種(zhong)緩沖(chong)液(ye)必(bi)須使(shi)用(yong)Tris堿制備(bei)，再用(yong)HCL調(tiao)節PH值，而不用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原溶(rong)液(ye)N，N，N’N’四(si)甲基乙(yi)二胺(an)催(cui)化(hua)過(guo)硫#銨(an)形(xing)成(cheng)自由基而加速兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀酰胺的(de)聚合(he)。PH太(tai)低時(shi)，聚合(he)反(fan)應受到抑制。0%（w/v）過(guo)硫#胺(an)溶(rong)液(ye)。提(ti)供兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀酰胺聚合(he)所(suo)必(bi)須的(de)自由基。去(qu)離子(zi)水配制數(shu)ml，臨(lin)用(yong)前配制.

6、 SDS- PAGE加樣緩沖(chong)液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖(chong)液(ye)8ml，甘(gan)油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚(fen)藍(lan).6ml，H2O 32ml混(hun)勻(yun)備(bei)用(yong)。按:或:2比(bi)例與(yu)蛋白質(zhi)樣品(pin)混(hun)合(he)，在(zai)沸水(shui)終(zhong)煮3min混(hun)勻(yun)後(hou)再(zai)上樣，壹般(ban)為(wei)20-25ul，總蛋白量(liang)00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨#電(dian)泳(yong)緩沖(chong)液(ye):30.3gTris，88g甘(gan)氨#，0gSDS，用(yong)蒸餾水溶(rong)解至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨#電(dian)極緩沖(chong)液(ye)。臨(lin)用(yong)前稀(xi)釋0倍(bei)。

8、 轉移(yi)緩沖(chong)液(ye)：配制L轉移(yi)緩沖(chong)液(ye)，需(xu)稱(cheng)取2.9g甘(gan)氨#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並加入(ru)200ml甲(jia)醇，加水(shui)至總量(liang)L。

9、 麗(li)春紅(hong)染(ran)液(ye)儲(chu)存(cun)液(ye)：麗(li)春(chun)紅(hong)S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺(huang)基水(shui)楊# 30g 加水(shui)至00ml 用(yong)時(shi)上述儲(chu)存(cun)液(ye)稀(xi)釋(shi)0倍(bei)即成(cheng)麗春紅(hong)S使(shi)用(yong)液(ye)。使(shi)用(yong)後應予以(yi)廢(fei)棄(qi)。

0、 脫脂奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉(na)（有(you)毒，戴手(shou)套(tao)操(cao)作），溶(rong)於磷(lin)#緩沖(chong)鹽溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖(chong)鹽溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗(kang)人-MMP-9（6）鼠抗(kang)人-TIMP-。

4、 過(guo)氧化(hua)物(wu)酶(mei)標記(ji)的(de)第(di)二(er)抗(kang)體。

5、 NBT（溶(rong)於70%二(er)甲基甲(jia)酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於00%二(er)甲基甲(jia)酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA Lysozyme  做(zuo)線(xian)粒(li)體膜(mo)UCP2蛋白的(de)Western Blot （以(yi)下(xia)簡(jian)寫成(cheng)Western Blot），提取線(xian)粒(li)體後(hou)凍存（未(wei)加蛋白酶(mei)抑制劑(ji)），樣品(pin)不能(neng)反(fan)復凍融;，加蛋白酶(mei)抑制劑(ji)。同(tong)時(shi)，建議檢(jian)查(zha)Western Blot過(guo)程， 提高(gao)壹抗(kang)濃度(du)。對(dui)於加蛋白酶(mei)抑制劑(ji)來說(shuo)，壹般(ban)加PMSF就(jiu)可(ke)以(yi)了(le)，能(neng)多(duo)加幾(ji)中(zhong)種(zhong)蛋白酶(mei)抑制劑(ji)。
同(tong)壹蛋白樣品(pin)能(neng)同(tong)時(shi)進(jin)行兩種(zhong)因子(zi)的(de)Western Blot檢(jian)測(ce)，有(you)的(de)甚至可(ke)以(yi)同(tong)時(shi)測幾(ji)十種(zhong)樣品(pin)。
如(ru)果(guo)是(shi)膜蛋白和(he)胞漿蛋白，所(suo)用(yong)的(de)去(qu)垢(gou)劑(ji)就要(yao)溫(wen)和得多(duo)，這時(shi)加上(shang)NaF去(qu)抑制磷(lin)#化(hua)酶(mei)的(de)活性(xing)。
樣品(pin)的(de)蛋白含(han)量(liang)很低(di)，每微(wei)升不到微(wei)克(ke)，但是(shi)在(zai)轉膜(mo)時(shi)經(jing)常(chang)會發現(xian)只(zhi)有(you)壹部(bu)分(fen)蛋白轉到了(le)膜(mo)上(shang)，就是(shi)在(zai)轉膜(mo)後染(ran)膠(jiao)發現(xian)有(you)的(de)孔所(suo)有(you)的(de)蛋白條帶都在(zai)，只(zhi)是(shi)顏(yan)色變淡了(le)，可(ke)以(yi)加大(da)上(shang)樣量(liang)，轉移(yi)時(shi)可(ke)以(yi)用(yong)減少(shao)電(dian)流(liu)延(yan)長(chang)時(shi)間，多加5-0%甲(jia)醇。
想(xiang)分離的(de)蛋白是(shi)分子(zi)量(liang)260kd的(de)，SDS-PAGE電(dian)泳(yong)的(de)分離膠(jiao)濃度(du)用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的(de)蛋白不好做(zuo)
如果(guo)上樣量(liang)超(chao)載，可(ke)以(yi)濃(nong)縮(suo)樣品(pin)，也(ye)可(ke)以(yi)根(gen)據(ju)妳的(de)目標分子(zi)量(liang)透析(xi)掉壹部(bu)分(fen)小分子(zi)蛋白。壹般(ban)地(di)，超(chao)載30%是(shi)不會(hui)有(you)問題的(de)。如果(guo)已經(jing)超(chao)了不少(shao)了，而且(qie)小(xiao)分子(zi)量(liang)的(de)也要(yao)，可(ke)以(yi)考(kao)慮(lv)加大(da)膠(jiao)的(de)厚度(du)，可(ke)以(yi)試(shi)試(shi).5mm的(de) comb。
蛋白變(bian)性(xing)後(hou)存(cun)放-80℃，壹兩(liang)年沒有(you)問題，zui關鍵(jian)兩條：不要(yao)被蛋白酶(mei)水解掉;不要(yao)被細(xi)菌消(xiao)化(hua)掉（也是(shi)被酶(mei)水解了）。
采用(yong)DAB顯色技術(shu)，二抗(kang)是(shi)化(hua)的(de)多克隆(long)抗(kang)體，三(san)抗(kang)是(shi)親(qin)和素(su)體(ti)系(xi)，不能(neng)使用(yong)脫脂奶粉，脫脂奶粉會(hui)影(ying)響(xiang)親(qin)和素(su)的(de)生成(cheng)，因(yin)為(wei)脫脂奶粉中(zhong)含，用(yong)BSA代替(ti)應該好壹點(dian).
Western Blot壹般(ban)上樣30-00微克(ke)不等(deng)，結(jie)果(guo)跟(gen)目的(de)蛋白的(de)豐度(du)、上(shang)樣量(liang)、壹二(er)抗(kang)的(de)量(liang)和撫育時(shi)間都有(you)關系(xi)，也(ye)與(yu)顯色時(shi)間長(chang)短有(you)關。開始摸(mo)條件(jian)時(shi)，為(wei)了拿(na)到陽(yang)性(xing)結(jie)果(guo)，各(ge)個步驟(zhou)都可(ke)以(yi)量(liang)多壹點(dian)時(shi)間長(chang)壹點(dian)，當然背景(jing)也就(jiu)出來了(le)。要(yao)拿到好的(de)結果(guo)，如果(guo)抗(kang)體好的(de)話比(bi)較容(rong)易(yi)，抗(kang)體不好的(de)話就需(xu)要(yao)反(fan)復地(di)試了(le)，當然有(you)的(de)不適(shi)合(he)Western Blot的(de)怎(zen)樣做(zuo)也不行。所(suo)以(yi)拿(na)到好的(de)結果(guo)不容(rong)易(yi)。