【概(gai)要(yao)描(miao)述(shu)】鼠(shu)抗人基質金屬(shu)蛋白酶(mei)3單克(ke)隆抗體 Matrix Metalloproteinase 3 Western Blot)是(shi)將(jiang)蛋白質(zhi)轉移(yi)到(dao)膜上(shang)，然後利(li)用抗體進(jin)行(xing)檢(jian)測。

鼠(shu)抗人基質金屬(shu)蛋白酶(mei)3單克(ke)隆抗體 Matrix Metalloproteinase 3 Western Blot技術:

公司(si)其(qi)他(ta)產(chan)品(pin)列(lie)表(biao)：http://www.hbzhan.com/st97028/list_36534.html

P56 兔抗人血管內皮(pi)生長因子(zi)-C多克(ke)隆(long)抗體 VEGF-C
LOP57 鼠(shu)抗人Villin單克(ke)隆抗體 Villin
 LOP526 β-澱(dian)粉樣(yang)物(wu)質 β-Amyloid
LOP527 鼠(shu)抗人β-連接(jie)素單克(ke)隆抗體 β-Catenin
LOP528 鼠(shu)抗β鏈單克(ke)隆抗體 β-Human Chorionic Gonadotropin （hCG）
LOP529 鼠(shu)抗人β-胰(yi)島(dao)素受(shou)體(ti)單克(ke)隆抗體 β-Insulin R
LOP530 鼠(shu)抗人γ-連接(jie)素單克(ke)隆抗體 γ-Catenin
適(shi)用於(yu)SABC試劑(ji)盒的即用型(xing)抗體工(gong)作(zuo)液(ye)
編 號 產(chan) 品(pin) 名(ming) 稱 價(jia) 格/規(gui) 格
LOP53 兔(tu)抗人、大鼠(shu)、小鼠(shu)Actin
LOP532 鼠(shu)抗人、大鼠(shu)、小鼠(shu)αSarcomeric Actin
LOP533 鼠(shu)抗人、大鼠(shu)、小鼠(shu)αSmooth muscle Actin 鼠(shu)抗人基質金屬(shu)蛋白酶(mei)3單克(ke)隆抗體 Matrix Metalloproteinase 3 壹(yi)、 原(yuan)理

與(yu)Southern或Northern雜(za)交(jiao)方法(fa)類似，但Western Blot采(cai)用的(de)是(shi)聚(ju)丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺(an)凝膠(jiao)電泳(yong)，被(bei)檢(jian)測物(wu)是(shi)蛋白質(zhi)，“探(tan)針(zhen)”是(shi)抗體，“顯(xian)色”用標(biao)記的(de)二抗。經(jing)過(guo)PAGE分離的蛋白質(zhi)樣(yang)品(pin)，轉移(yi)到(dao)固相(xiang)載體(ti)（例(li)如硝(xiao)#纖(xian)維(wei)素薄(bo)膜）上(shang)，固(gu)相(xiang)載體(ti)以(yi)非(fei)共(gong)價(jia)鍵(jian)形(xing)式(shi)吸(xi)附蛋白質(zhi)，且(qie)能保(bao)持(chi)電泳(yong)分(fen)離的多(duo)肽(tai)類(lei)型(xing)及其(qi)生物(wu)學活(huo)性(xing)不變(bian)。以(yi)固(gu)相(xiang)載體(ti)上(shang)的(de)蛋白質(zhi)或多(duo)肽(tai)作(zuo)為抗原(yuan)，與對應的抗體起(qi)免疫反(fan)應，再與(yu)酶或同位素標(biao)記的(de)第(di)二抗體起(qi)反(fan)應，經(jing)過(guo)底物(wu)顯(xian)色或(huo)放射自(zi)顯(xian)影以(yi)檢(jian)測電泳(yong)分(fen)離的特異性(xing)目的(de)基(ji)因表(biao)達(da)的蛋白成(cheng)分。該技術(shu)也(ye)廣泛應用於(yu)檢(jian)測蛋白水(shui)平的(de)表(biao)達(da)。

二、分類(lei) Matrix Metalloproteinase 3    現(xian)常(chang)用的(de)有底(di)物(wu)化學發(fa)光ECL和(he)底(di)物(wu)DAB呈(cheng)色(se)，體同水(shui)平和(he)實(shi)驗條(tiao)件(jian)的是(shi)用*種(zhong)方法(fa)，目前(qian)發(fa)表(biao)文(wen)章(zhang)通(tong)常(chang)是(shi)用底(di)物(wu)化學發(fa)光ECL。只(zhi)要(yao)買(mai)現(xian)成(cheng)的試劑盒就行，操作(zuo)也(ye)比(bi)較簡(jian)單，原(yuan)理如下(xia)（二抗用HRP標(biao)記）：反(fan)應底物(wu)為過氧化(hua)物(wu)+魯(lu)米諾，如遇(yu)到(dao)HRP，即發(fa)光，可(ke)使膠(jiao)片曝光，就可(ke)洗出條(tiao)帶。

三、 主(zhu)要(yao)試(shi)劑(ji)

、 丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺(an)和(he)N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺(an)，應以(yi)溫熱（以(yi)利(li)於(yu)溶解(jie)雙丙(bing)稀(xi)酰(xian)胺(an)）的(de)去(qu)離子(zi)水配(pei)制(zhi)含(han)有29%（w/v）丙(bing)稀(xi)酰(xian)胺(an)和(he)%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺(an)儲存(cun)液(ye)丙(bing)稀(xi)酰(xian)胺(an)29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉(cha)雙丙(bing)稀(xi)酰(xian)胺(an)g，加(jia)H2O至 00ml。）儲於(yu)棕色(se)瓶，4℃避光保存。嚴(yan)格核(he)實PH不得(de)超過7.0，因可(ke)以(yi)發(fa)生脫氨(an)基(ji)反(fan)應是(shi)光催(cui)化或堿催(cui)化的。使用期(qi)不得(de)超過兩(liang)個月，隔幾(ji)個月須(xu)重(zhong)新配(pei)制(zhi)。如有(you)沈澱，可(ke)以(yi)過(guo)濾 Matrix Metalloproteinase 32、 十(shi)二烷基(ji)硫(liu)#鈉SDS溶液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離子(zi)水配(pei)制(zhi)，室(shi)溫保存。

3、 分離膠緩(huan)沖液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混(hun)合(he)，加(jia)水(shui)稀(xi)釋到(dao)00ml終體(ti)積(ji)。過濾後(hou)40℃保存。

4、 濃(nong)縮(suo)膠(jiao)緩(huan)沖液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於(yu)40mlH2O中(zhong)，用約(yue)48ml mol/L HCl調至pH6.8加水(shui)稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終體(ti)積(ji)。過濾後(hou)40C保存。這兩(liang)種緩(huan)沖液(ye)必(bi)須(xu)使用Tris堿制備，再(zai)用HCL調節PH值(zhi)，而(er)不用 Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶液(ye)N，N，N’N’四甲基(ji)乙(yi)二胺(an)催(cui)化過硫(liu)#銨(an)形(xing)成(cheng)自(zi)由基而(er)加(jia)速(su)兩(liang)種丙(bing)稀(xi)酰(xian)胺(an)的聚(ju)合(he)。PH太(tai)低時，聚(ju)合(he)反(fan)應受(shou)到(dao)抑制(zhi)。0%（w/v）過硫#胺(an)溶液(ye)。提(ti)供(gong)兩(liang)種丙(bing)稀(xi)酰(xian)胺(an)聚(ju)合(he)所(suo)必(bi)須(xu)的(de)自(zi)由基。去(qu)離子(zi)水配(pei)制(zhi)數ml，臨用前(qian)配(pei)制(zhi).

6、 SDS- PAGE加樣(yang)緩(huan)沖液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖液(ye)8ml，甘(gan)油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基(ji)乙醇(chun)3.2ml，0.05%溴(xiu)酚(fen)藍(lan).6ml，H2O 32ml混(hun)勻(yun)備(bei)用。按(an):或:2比例(li)與(yu)蛋白質(zhi)樣(yang)品(pin)混(hun)合(he)，在(zai)沸水(shui)終煮3min混(hun)勻(yun)後(hou)再上(shang)樣(yang)，壹(yi)般(ban)為20-25ul，總蛋白量(liang)00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨(an)#電泳(yong)緩(huan)沖液(ye):30.3gTris，88g甘(gan)氨(an)#，0gSDS，用蒸(zheng)餾水(shui)溶解(jie)至000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨(an)#電極緩沖液(ye)。臨用前(qian)稀釋(shi)0倍(bei)。

8、 轉(zhuan)移緩(huan)沖液(ye)：配(pei)制(zhi)L轉(zhuan)移緩沖液(ye)，需(xu)稱取2.9g甘(gan)氨(an)#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並加入200ml甲醇(chun)，加水至總量(liang)L。

9、 麗春紅染液(ye)儲存(cun)液(ye)：麗(li)春紅S 2g 三#乙(yi)#30g 磺(huang)基水(shui)楊# 30g 加(jia)水(shui)至00ml 用時上(shang)述(shu)儲存(cun)液(ye)稀(xi)釋0倍即成(cheng)麗(li)春紅S使用液(ye)。使用後(hou)應予以(yi)廢(fei)棄(qi)。

0、 脫(tuo)脂(zhi)奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉（有毒，戴手(shou)套(tao)操作），溶於(yu)磷#緩沖鹽(yan)溶液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖鹽(yan)溶液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗人-MMP-9（6）鼠(shu)抗人-TIMP-。

4、 過(guo)氧化(hua)物(wu)酶標(biao)記的(de)第(di)二抗體。

5、 NBT（溶於(yu)70%二甲基(ji)甲(jia)酰(xian)胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於(yu)00%二甲基(ji)甲(jia)酰(xian)胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA  做(zuo)線(xian)粒體(ti)膜UCP2蛋白的(de)Western Blot （以(yi)下(xia)簡(jian)寫成Western Blot），提取線(xian)粒體(ti)後(hou)凍存（未(wei)加(jia)蛋白酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)），樣(yang)品(pin)不能反(fan)復凍融;，加(jia)蛋白酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)。同(tong)時，建(jian)議(yi)檢(jian)查Western Blot過(guo)程， 提(ti)高(gao)壹抗濃(nong)度(du)。對於(yu)加蛋白酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)來(lai)說(shuo)，壹(yi)般(ban)加(jia)PMSF就(jiu)可(ke)以(yi)了(le)，能(neng)多加幾(ji)中(zhong)種(zhong)蛋白酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)。
同(tong)壹(yi)蛋白樣(yang)品(pin)能同(tong)時進(jin)行(xing)兩(liang)種因子(zi)的Western Blot檢(jian)測，有(you)的甚至可(ke)以(yi)同(tong)時測幾(ji)十種(zhong)樣(yang)品(pin)。
如果是(shi)膜蛋白和(he)胞(bao)漿(jiang)蛋白，所(suo)用的(de)去(qu)垢劑(ji)就要(yao)溫和(he)得(de)多(duo)，這(zhe)時加上(shang)NaF去(qu)抑制(zhi)磷#化酶(mei)的(de)活(huo)性(xing)。
樣(yang)品(pin)的蛋白含(han)量很(hen)低(di)，每微(wei)升(sheng)不到(dao)微克(ke)，但是(shi)在(zai)轉膜時經(jing)常(chang)會(hui)發(fa)現(xian)只(zhi)有(you)壹(yi)部(bu)分蛋白轉(zhuan)到(dao)了(le)膜上(shang)，就(jiu)是(shi)在(zai)轉膜後染膠(jiao)發(fa)現(xian)有(you)的孔(kong)所(suo)有的蛋白條(tiao)帶都(dou)在(zai)，只(zhi)是(shi)顏(yan)色變(bian)淡(dan)了(le)，可(ke)以(yi)加(jia)大上(shang)樣(yang)量(liang)，轉(zhuan)移(yi)時可(ke)以(yi)用減(jian)少電流(liu)延(yan)長(chang)時間(jian)，多加5-0%甲醇(chun)。
想(xiang)分離的蛋白是(shi)分子(zi)量260kd的(de)，SDS-PAGE電泳(yong)的(de)分離膠濃(nong)度(du)用6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的(de)蛋白不好做(zuo)
如果上(shang)樣(yang)量(liang)超載，可(ke)以(yi)濃(nong)縮(suo)樣(yang)品(pin)，也可(ke)以(yi)根據妳的目標(biao)分子(zi)量透(tou)析掉壹部(bu)分小分(fen)子(zi)蛋白。壹(yi)般地(di)，超載30%是(shi)不會(hui)有(you)問題(ti)的。如果已(yi)經(jing)超了(le)不少了(le)，而(er)且(qie)小分(fen)子(zi)量的(de)也(ye)要(yao)，可(ke)以(yi)考(kao)慮加大膠(jiao)的(de)厚(hou)度(du)，可(ke)以(yi)試(shi)試.5mm的 comb。
蛋白變(bian)性(xing)後(hou)存(cun)放-80℃，壹兩(liang)年沒(mei)有問題(ti)，zui關鍵(jian)兩(liang)條：不要(yao)被(bei)蛋白酶(mei)水解(jie)掉;不要(yao)被(bei)細(xi)菌(jun)消(xiao)化(hua)掉（也是(shi)被酶(mei)水解了(le)）。
采(cai)用DAB顯(xian)色技(ji)術，二抗是(shi)化的(de)多克隆抗體，三抗是(shi)親和(he)素體系，不能使用脫(tuo)脂奶(nai)粉，脫脂(zhi)奶粉會(hui)影(ying)響(xiang)親和(he)素的生成，因為脫脂(zhi)奶(nai)粉中(zhong)含(han)，用BSA代(dai)替(ti)應該好壹(yi)點(dian).
Western Blot壹般上(shang)樣(yang)30-00微(wei)克(ke)不等(deng)，結(jie)果跟(gen)目的(de)蛋白的(de)豐度(du)、上(shang)樣(yang)量(liang)、壹(yi)二抗的量(liang)和(he)撫育(yu)時間(jian)都有關系，也與(yu)顯(xian)色時間(jian)長短有關。開始(shi)摸條件(jian)時，為了(le)拿(na)到(dao)陽(yang)性(xing)結(jie)果，各(ge)個步驟(zhou)都可(ke)以(yi)量(liang)多壹點時間(jian)長壹點，當(dang)然背景(jing)也就(jiu)出來(lai)了(le)。要(yao)拿(na)到(dao)好的(de)結(jie)果，如果抗體好(hao)的(de)話比較容易(yi)，抗體不好的(de)話就(jiu)需(xu)要(yao)反(fan)復地(di)試了(le)，當(dang)然有的(de)不適合(he)Western Blot的(de)怎樣(yang)做(zuo)也不行。所(suo)以(yi)拿(na)到(dao)好的(de)結(jie)果不容易(yi)。