【概(gai)要(yao)描(miao)述(shu)】兔氣(qi)管(guan)上皮(pi)細(xi)胞的(de)相關產品(pin)：HCC-1833人(ren)肺腺癌(ai)細(xi)胞兔原(yuan)代(dai)小腸粘(zhan)膜(mo)上皮(pi)細(xi)胞人(ren)原(yuan)代(dai)視網(wang)膜(mo)微(wei)血(xue)管內皮細(xi)胞大鼠原代(dai)腸間質細(xi)胞小鼠原代(dai)脊髓微(wei)血(xue)管內皮細(xi)胞兔原(yuan)代(dai)肝星狀細(xi)胞小鼠原代(dai)胚(pei)胎(tai)成纖(xian)維細(xi)胞小鼠原代(dai)頸動脈(mai)成纖(xian)維細(xi)胞人(ren)原(yuan)代(dai)頜(he)下腺上皮(pi)細(xi)胞兔原(yuan)代(dai)股(gu)骨(gu)頭(tou)微(wei)血(xue)管內皮細(xi)胞

兔氣(qi)管(guan)上皮(pi)細(xi)胞

包被條件(jian) 鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培(pei)養基(ji) 含(han)FBS、生長(chang)添(tian)加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液(ye)頻(pin)率(lv) 每2-3天換液(ye)壹(yi)次

生長(chang)特(te)性 貼(tie)壁

細(xi)胞形態(tai) 上皮(pi)細(xi)胞樣

傳代(dai)特(te)性 可(ke)傳1-2代(dai)

消化(hua)液(ye) 0.25%yi蛋(dan)白酶

培(pei)養條件(jian) 氣(qi)相(xiang)：空氣，95%；CO2，5%

兔氣(qi)管(guan)上皮(pi)分離自氣管(guan)組(zu)織(zhi)；氣管(guan)（Trachea），呼吸器官(guan)的(de)壹(yi)部分；為後(hou)壁(bi)略平(ping)的(de)圓筒型(xing)管狀。上端(duan)平(ping)第(di)六頸(jing)椎下緣，與(yu)環狀軟(ruan)骨(gu)相連(lian)；向(xiang)下至第(di)四(si)、五胸(xiong)椎(zhui)體（相當胸(xiong)骨(gu)角平(ping)面(mian)）交(jiao)界(jie)處，分左(zuo)、右(you)主支(zhi)氣(qi)管，分叉處稱(cheng)為氣(qi)管(guan)杈(cha)。氣管主要(yao)由(you)14-16個(ge)半環(huan)狀軟(ruan)骨(gu)構成(cheng)，有(you)彈(dan)性，軟骨(gu)為“C"字(zi)形的(de)軟骨(gu)環，缺口(kou)向後(hou)，各(ge)軟骨(gu)環以(yi)韌(ren)帶(dai)連(lian)接(jie)起來(lai)，環後(hou)方(fang)缺口(kou)處由(you)平(ping)滑肌和(he)致(zhi)密(mi)結(jie)締組(zu)織連(lian)接(jie)，保(bao)持了持續(xu)張(zhang)開(kai)狀態(tai)。管(guan)腔襯以(yi)粘(zhan)膜(mo)，表(biao)面(mian)覆(fu)蓋(gai)纖(xian)毛(mao)上皮(pi)，粘(zhan)膜(mo)分泌的(de)粘(zhan)液(ye)可(ke)粘(zhan)附(fu)吸入(ru)空(kong)氣中(zhong)的(de)灰塵顆(ke)粒，纖(xian)毛(mao)不斷向咽部擺動將(jiang)粘(zhan)液(ye)與(yu)灰塵排出(chu)，以(yi)凈(jing)化(hua)吸入(ru)的(de)氣體。氣(qi)管上皮(pi)是(shi)氣(qi)道(dao)與(yu)外(wai)界(jie)環(huan)境接(jie)觸的(de)道(dao)防線，不(bu)僅是(shi)各(ge)種病(bing)原體(ti)、炎癥介(jie)質作用(yong)的(de)靶細(xi)胞，還(hai)作為(wei)效(xiao)應(ying)細(xi)胞合成、釋(shi)放多(duo)種炎(yan)性介(jie)質和(he)細(xi)胞因子從而(er)參(can)與氣(qi)道(dao)炎(yan)癥及(ji)免(mian)疫反應(ying)。體(ti)外(wai)培(pei)養的(de)原代(dai)氣管上皮(pi)細(xi)胞因與體內組織(zhi)在形態(tai)結(jie)構和(he)功能活動上存在很(hen)大的(de)相似(si)性，因此，在基(ji)礎及(ji)臨床研(yan)究中極為(wei)重(zhong)要。
方(fang)法簡(jian)介(jie)：

公(gong)司實(shi)驗(yan)室(shi)分離的(de)兔氣(qi)管(guan)上皮(pi)采(cai)用(yong)鏈(lian)黴(mei)蛋(dan)白-中性蛋(dan)白混(hun)合消化(hua)法結(jie)合差速貼(tie)壁法，並(bing)通(tong)過上皮(pi)細(xi)胞專用(yong)培(pei)養基(ji)培(pei)養篩(shai)選(xuan)制備而來(lai)，細(xi)胞總量(liang)約為5×10?cells/瓶。
質量(liang)檢測：

公(gong)司實(shi)驗(yan)室(shi)分離的(de)兔氣(qi)管(guan)上皮(pi)經PCK免(mian)疫熒(ying)光(guang)鑒定，純(chun)度(du)可(ke)達90%以(yi)上，且(qie)不(bu)含(han)有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原(yuan)體(ti)、細(xi)菌、酵母(mu)和真(zhen)菌等。

壹(yi)、細(xi)胞培養

1取(qu)材(cai) 在無(wu)菌環境下從機體取(qu)出(chu)某種(zhong)組織(zhi)細(xi)胞（視實(shi)驗(yan)目(mu)的(de)而定），經過壹(yi)定的(de)處理(li)（如消化(hua)分散細(xi)胞、分離等）後(hou)接(jie)入(ru)培(pei)養器(qi)血(xue)中，這(zhe)壹(yi)過程(cheng)稱(cheng)為(wei)取(qu)材(cai)。如(ru)是(shi)細(xi)胞株的(de)擴大培養則(ze)無取(qu)材(cai)這(zhe)壹(yi)過程(cheng)。機體取(qu)出(chu)的(de)組織細(xi)胞的(de)培養稱(cheng)為原(yuan)代(dai)培養。2培(pei)養 將(jiang)取(qu)得(de)的(de)組織細(xi)胞接(jie)入(ru)培(pei)養瓶或培(pei)養板(ban)中的(de)過程(cheng)稱(cheng)為(wei)培(pei)養。3凍(dong)存及(ji)復(fu)蘇(su)（可(ke)參(can)閱後(hou)面(mian)有(you)關章節）為(wei)了保(bao)存細(xi)胞，特(te)別(bie)是(shi)不(bu)易獲得(de)的(de)突變(bian)型(xing)細(xi)胞或細(xi)胞株，要(yao)將(jiang)細(xi)胞凍存。凍存的(de)溫度壹(yi)般用(yong)液(ye)氮(dan)的(de)溫度－196℃，將(jiang)細(xi)胞收集(ji)至凍(dong)存管中(zhong)加(jia)入(ru)含(han)保(bao)護劑(ji)（壹(yi)般為(wei)二甲亞(ya)碸或(huo)甘(gan)油）的(de)培養基(ji)，以(yi)壹(yi)定的(de)冷卻(que)速度(du)凍存，最終(zhong)保(bao)存於液(ye)氮(dan)中。在極(ji)低的(de)溫度下，細(xi)胞保(bao)存的(de)時間幾(ji)乎是(shi)無(wu)限的(de)。復(fu)蘇(su)壹(yi)般采(cai)用(yong)快(kuai)融(rong)方(fang)法，即(ji)從液(ye)氮(dan)中取(qu)出(chu)凍(dong)存管後(hou)，立(li)即(ji)放入(ru)37℃水(shui)中(zhong)，使(shi)之(zhi)在壹(yi)分鐘內迅速融(rong)解。然後(hou)將(jiang)細(xi)胞轉入(ru)培(pei)養器(qi)皿中進(jin)行培(pei)養。

二(er)、原代(dai)細(xi)胞分離

凡(fan)是(shi)來(lai)源於胚(pei)胎(tai)、組織(zhi)器官(guan)及(ji)外周血(xue)，經特(te)殊分離方(fang)法制備而來(lai)的(de)原初培養的(de)細(xi)胞稱之(zhi)為(wei)原(yuan)代(dai)細(xi)胞。1懸浮(fu)細(xi)胞的(de)分離方(fang)法組(zu)織材料若來(lai)自血(xue)液(ye)、羊水(shui)、胸(xiong)水(shui)或(huo)腹(fu)水(shui)的(de)懸液(ye)材(cai)料，的(de)方(fang)法是(shi)采(cai)用(yong)1000r/min的(de)低速離(li)心(xin)10分鐘。經離心(xin)後(hou)由(you)於各(ge)種細(xi)胞的(de)比重不(bu)同可(ke)在分層液(ye)中(zhong)形成(cheng)不(bu)同(tong)層，這(zhe)樣可(ke)根據需(xu)要收獲(huo)目(mu)的(de)細(xi)胞。2實(shi)體(ti)組織材(cai)料的(de)分離方(fang)法對於實(shi)體(ti)組織材(cai)料，由(you)於細(xi)胞間結(jie)合緊密(mi)，為了使(shi)組(zu)織(zhi)中的(de)細(xi)胞充分分散，形成(cheng)細(xi)胞懸液(ye)，可(ke)采(cai)用(yong)機械分散法（物(wu)理(li)裂(lie)解(jie)）和(he)消化(hua)分離法。

三(san)、細(xi)胞增殖(zhi)檢(jian)測(ce)技術

目(mu)前(qian)主要(yao)有(you)兩種用(yong)於檢(jian)測(ce)細(xi)胞增殖(zhi)能(neng)力(li)的(de)方(fang)法。壹(yi)種是(shi)直(zhi)接(jie)的(de)方(fang)法，通(tong)過直(zhi)接(jie)測(ce)定進(jin)行分裂(lie)

的(de)細(xi)胞數(shu)來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞的(de)增殖(zhi)能(neng)力(li)。另(ling)壹(yi)種是(shi)間接(jie)的(de)方(fang)法，即(ji)細(xi)胞活力(li)（cell viability）檢(jian)測方(fang)法，通(tong)過檢(jian)測(ce)樣(yang)品(pin)中(zhong)健(jian)康(kang)細(xi)胞的(de)數(shu)目(mu)來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞的(de)增殖(zhi)能(neng)力(li)。顯(xian)然，細(xi)胞活力(li)檢(jian)測法並(bing)不能最(zui)終證(zheng)明檢測樣(yang)品(pin)中(zhong)的(de)細(xi)胞是(shi)否(fou)在增殖(zhi)。如(ru)細(xi)胞在某壹(yi)培養條件(jian)下會自(zi)發啟動雕亡程(cheng)序(xu)，但藥(yao)物(wu)的(de)幹擾(rao)可(ke)抑(yi)制雕亡的(de)發生；這(zhe)時(shi)若采(cai)用(yong)細(xi)胞活力(li)檢(jian)測法，顯(xian)然可(ke)以區分兩種條件(jian)下的(de)細(xi)胞數(shu)量(liang)，但我(wo)們並(bing)不能從(cong)藥(yao)物(wu)幹擾(rao)組細(xi)胞數(shu)大於對照(zhao)組(zu)的(de)事實(shi)說(shuo)明藥(yao)物(wu)可(ke)促進(jin)細(xi)胞增殖(zhi)的(de)結(jie)論。所(suo)以(yi)最(zui)直接(jie)的(de)證據應(ying)該采(cai)用(yong)方(fang)法壹(yi)。

取(qu)材(cai)：首(shou)先(xian)，用(yong)培(pei)養液(ye)濕(shi)潤所(suo)取(qu)的(de)組織材(cai)料，並(bing)用(yong)鋒(feng)利(li)的(de)眼(yan)科(ke)剪去(qu)除附(fu)在其(qi)上的(de)脂(zhi)肪(fang)和(he)結(jie)締組(zu)織。接(jie)著用(yong)平(ping)衡(heng)液(ye)（如(ru)PBS或Hanks液(ye)）漂洗，再用(yong)眼(yan)科(ke)彎剪將(jiang)組(zu)織(zhi)塊(kuai)剪成(cheng)小(xiao)塊(kuai)。多(duo)次用(yong)PBS或(huo)Hanks液(ye)漂洗，直到(dao)液(ye)體(ti)清(qing)亮、無(wu)油(you)滴為止。

接(jie)種(zhong)：用(yong)濕(shi)潤的(de)吸管吸取(qu)切(qie)碎的(de)組織塊(kuai)，輕輕吹到(dao)培(pei)養瓶皿中，並(bing)按壹(yi)定間距(ju)均(jun)勻(yun)放在培(pei)養瓶底壁(bi)上。註(zhu)意(yi)不(bu)要過多(duo)，確(que)保(bao)組織(zhi)塊(kuai)切(qie)面(mian)貼(tie)在培(pei)養瓶底壁(bi)上。

培(pei)養：將(jiang)培(pei)養瓶翻轉，使(shi)瓶底朝(chao)上，在種(zhong)植了組織(zhi)塊(kuai)壹(yi)側的(de)對側(ce)面(mian)加(jia)足培(pei)養液(ye)，避(bi)免(mian)組織(zhi)塊(kuai)與培(pei)養液(ye)接(jie)觸，然後(hou)塞緊瓶塞。將(jiang)種(zhong)植了組織(zhi)塊(kuai)的(de)壹(yi)側朝(chao)上，靜(jing)置於37℃培(pei)養箱(xiang)中(zhong)。待組(zu)織(zhi)塊(kuai)貼壁(bi)1到(dao)3小(xiao)時(shi)後(hou)翻(fan)瓶，使(shi)貼(tie)壁(bi)的(de)組織塊(kuai)浸(jin)沒(mei)在培(pei)養液(ye)中(zhong)，繼(ji)續靜(jing)置。換液(ye)：每隔2到(dao)3天更(geng)換壹(yi)次培(pei)養液(ye)，或(huo)者根據培養瓶種顏色的(de)變化(hua)確(que)定換液(ye)時(shi)間。

壹(yi)、原代(dai)細(xi)胞計數(shu)

將(jiang)血(xue)球計數(shu)板(ban)及(ji)蓋片(pian)用(yong)擦(ca)試幹凈，並(bing)將(jiang)蓋(gai)片(pian)蓋(gai)在計數(shu)板(ban)上。

將(jiang)細(xi)胞懸液(ye)吸出少(shao)許(xu)，滴加(jia)在蓋(gai)片(pian)邊(bian)緣，使(shi)懸(xuan)液(ye)充滿蓋(gai)片(pian)和(he)計數(shu)板(ban)之(zhi)間。

靜(jing)置3分鐘。

鏡下觀(guan)察(cha)，計算(suan)計數(shu)板(ban)四(si)大格細(xi)胞總數(shu)，壓(ya)線細(xi)胞只(zhi)計左(zuo)側(ce)和(he)上方(fang)的(de)。然後(hou)按(an)下式(shi)計算(suan)：

細(xi)胞數(shu)/ml＝4大格細(xi)胞總數(shu)/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡(jing)下偶見(jian)由(you)兩個以(yi)上細(xi)胞組成(cheng)的(de)細(xi)胞團，應(ying)按(an)單個(ge)細(xi)胞計算(suan)，若細(xi)胞團占(zhan)10%以上，說(shuo)明(ming)分散不好(hao)，需(xu)重新(xin)制備細(xi)胞懸液(ye)。

二、原代(dai)細(xi)胞活力(li)

將(jiang)細(xi)胞懸液(ye)以(yi)0.5ml加(jia)入(ru)試管中。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺盼蘭(lan)染液(ye)，染(ran)色2壹(yi)3分鐘。

吸取(qu)少(shao)許(xu)懸(xuan)液(ye)塗(tu)於載(zai)玻片(pian)上，加(jia)上蓋(gai)片(pian)。

鏡(jing)下取(qu)幾(ji)個(ge)任意(yi)視野分別(bie)計死細(xi)胞和活(huo)細(xi)胞數(shu)，計細(xi)胞活力(li)。

死細(xi)胞能被(bei)臺盼蘭(lan)染上色(se)，鏡(jing)下可(ke)見深(shen)蘭(lan)色的(de)細(xi)胞，活細(xi)胞不被(bei)染色，鏡下呈無(wu)色透(tou)明(ming)狀。

活力(li)測(ce)定可(ke)以和(he)細(xi)胞計數(shu)合起來(lai)進行，但要考慮到(dao)染(ran)液(ye)對原(yuan)細(xi)胞懸液(ye)的(de)加(jia)倍(bei)稀釋(shi)作用(yong)。