【概(gai)要(yao)描述】兔骨內膜間充質幹(gan)細胞(bao)的(de)相關產(chan)品：HPMVEC人肺微(wei)血(xue)管內皮細胞小鼠原(yuan)代B淋巴(ba)細(xi)胞人原(yuan)代扁桃(tao)體動脈內皮細胞大(da)鼠原(yuan)代腎足細胞大(da)鼠原(yuan)代陰(yin)道(dao)上皮細胞大(da)鼠原(yuan)代室(shi)管膜細胞(bao)人原(yuan)代腎小球(qiu)系(xi)膜細胞(bao)兔胃(wei)黏膜上皮細胞大(da)鼠原(yuan)代胰島β細(xi)胞(bao)人原(yuan)代小腸(chang)粘膜上皮細胞

兔骨內膜間充質幹(gan)細胞(bao)

培(pei)養基 含(han)FBS、生(sheng)長添(tian)加劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液(ye)頻(pin)率 每(mei)2-3天(tian)換液(ye)壹(yi)次(ci)

生(sheng)長特性(xing) 貼(tie)壁(bi)

細(xi)胞形態(tai) 成纖維細胞樣(yang)

傳(chuan)代特性(xing) 可(ke)傳5代左(zuo)右(you)；3代以(yi)內狀態(tai)

消(xiao)化(hua)液(ye) 0.25%yi蛋(dan)白酶(mei)

培(pei)養條(tiao)件(jian) 氣(qi)相：空氣(qi)，95%；CO2，5%

兔骨內膜間充質幹(gan)分(fen)離自(zi)股(gu)骨、脛骨；骨內膜是壹(yi)層(ceng)致(zhi)密(mi)結締組(zu)織膜，覆蓋在(zai)骨的表(biao)面(mian)（關節(jie)面(mian)除(chu)外），新鮮(xian)骨內膜呈(cheng)粉(fen)紅色，含(han)有(you)豐富(fu)的(de)血(xue)管、神經(jing)和成骨細胞。此外，附著於骨的肌腱、韌(ren)帶(dai)於(yu)附著部位(wei)都與(yu)骨內膜編織在壹(yi)起。因而骨內膜與骨質結合甚(shen)為牢固(gu)。骨內膜富(fu)含(han)血(xue)管、神經(jing)，通(tong)過骨質的(de)滋養(yang)孔(kong)分(fen)布於(yu)骨質和骨髓。骨內膜分(fen)內、外兩(liang)層(ceng)，外層(ceng)主(zhu)要是粗大(da)的膠(jiao)原(yuan)纖維束，部分(fen)纖維穿(chuan)入(ru)骨質，使(shi)骨內膜固(gu)定(ding)於骨面(mian)；內(nei)層(ceng)疏(shu)松(song)，含(han)成骨細胞和破骨細胞（分(fen)別具有(you)產(chan)生新(xin)骨質和改建骨的功能）。骨髓腔(qiang)和骨松(song)質的(de)網眼也襯(chen)著壹(yi)層(ceng)菲薄的(de)結締組(zu)織膜，叫做(zuo)骨膜。骨內膜的內(nei)層(ceng)和骨膜有(you)分(fen)化成骨細胞和破骨細胞的能力，以(yi)形成新骨質和破壞、改造已(yi)生成的骨質，所(suo)以(yi)對骨的發生、生(sheng)長(chang)、修(xiu)復等(deng)具有(you)重要意(yi)義(yi)。骨內膜間充質幹(gan)細胞(bao)是(shi)壹(yi)種(zhong)具有(you)高度自(zi)我(wo)更新(xin)能力和多向分(fen)化潛(qian)能的幹(gan)細胞(bao)，可(ke)以(yi)向骨、軟(ruan)骨、肌組(zu)織、皮膚(fu)、脂肪、神經等(deng)多種(zhong)組(zu)織分(fen)化，因此可(ke)以(yi)作為(wei)組(zu)織工程(cheng)中的種(zhong)子(zi)細(xi)胞。骨內膜間充質幹(gan)細胞(bao)的(de)體(ti)外培(pei)養條(tiao)件(jian)要(yao)求較高(gao)，在(zai)培(pei)養過程(cheng)中，受貼壁(bi)時間、種(zhong)植密(mi)度、血(xue)清含量、培(pei)養溫度(du)和培(pei)養基pH值等(deng)條(tiao)件(jian)的(de)影(ying)響。
方(fang)法簡介：

公司(si)實驗室(shi)分(fen)離的兔骨內膜間充質幹(gan)采用沖洗(xi)骨髓、消(xiao)化(hua)骨內膜、差速(su)貼(tie)壁(bi)法結合培(pei)養基篩選(xuan)制(zhi)備而來，細(xi)胞總量約(yue)為5×10?cells/瓶。
質量檢(jian)測(ce)：

公司(si)實驗室(shi)分(fen)離的兔骨內膜間充質幹(gan)經CD90免(mian)疫熒(ying)光(guang)鑒定(ding)，純度(du)可(ke)達90%以(yi)上，且不(bu)含有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原(yuan)體、細菌、酵母(mu)和真菌等。

壹(yi)、細胞(bao)培(pei)養

1取(qu)材(cai) 在(zai)無(wu)菌環境下從機(ji)體(ti)取(qu)出(chu)某(mou)種(zhong)組(zu)織細胞(bao)（視實驗目的(de)而定），經(jing)過壹(yi)定的(de)處(chu)理(li)（如消(xiao)化(hua)分(fen)散細胞(bao)、分(fen)離等）後(hou)接入(ru)培(pei)養器血(xue)中，這(zhe)壹(yi)過程(cheng)稱(cheng)為(wei)取(qu)材(cai)。如是細胞(bao)株的擴(kuo)大(da)培(pei)養則無(wu)取(qu)材(cai)這(zhe)壹(yi)過程(cheng)。機(ji)體(ti)取(qu)出(chu)的(de)組(zu)織細胞(bao)的培(pei)養稱為(wei)原(yuan)代培(pei)養。2培(pei)養 將取(qu)得的組(zu)織細胞(bao)接入(ru)培(pei)養瓶或培(pei)養板中的過程(cheng)稱(cheng)為(wei)培(pei)養。3凍存及復(fu)蘇（可(ke)參閱(yue)後(hou)面(mian)有(you)關章(zhang)節(jie)）為了(le)保存細胞(bao)，特別(bie)是不(bu)易獲得的突變型細(xi)胞(bao)或細(xi)胞(bao)株，要將(jiang)細胞(bao)凍(dong)存。凍存的溫(wen)度壹(yi)般用(yong)液(ye)氮(dan)的(de)溫(wen)度(du)－196℃，將細(xi)胞(bao)收(shou)集至凍(dong)存管中加入(ru)含(han)保(bao)護(hu)劑(ji)（壹(yi)般為(wei)二(er)甲(jia)亞(ya)碸(feng)或甘(gan)油(you)）的培(pei)養基，以(yi)壹(yi)定的(de)冷(leng)卻(que)速(su)度(du)凍(dong)存，最終保存於液(ye)氮(dan)中。在極低(di)的溫(wen)度下，細(xi)胞(bao)保(bao)存的時間幾乎(hu)是無(wu)限(xian)的。復(fu)蘇壹(yi)般采用快(kuai)融(rong)方法，即從液(ye)氮(dan)中取(qu)出(chu)凍(dong)存管後，立即放(fang)入(ru)37℃水(shui)中，使(shi)之在壹(yi)分(fen)鐘內迅速(su)融(rong)解。然後(hou)將(jiang)細(xi)胞轉入(ru)培(pei)養器皿中進(jin)行培(pei)養。

二(er)、原(yuan)代細(xi)胞(bao)分(fen)離

凡(fan)是(shi)來(lai)源(yuan)於胚胎、組(zu)織器官(guan)及外周血(xue)，經特殊(shu)分(fen)離方法制備而來的(de)原(yuan)初培(pei)養的細(xi)胞(bao)稱(cheng)之為(wei)原(yuan)代細(xi)胞(bao)。1懸(xuan)浮(fu)細胞的(de)分(fen)離方法組(zu)織材料(liao)若來自(zi)血(xue)液(ye)、羊(yang)水、胸(xiong)水或腹(fu)水(shui)的懸液(ye)材料(liao)，的方法是采用1000r/min的低(di)速(su)離心10分(fen)鐘。經離心後(hou)由於(yu)各(ge)種(zhong)細胞(bao)的比(bi)重不(bu)同可(ke)在分(fen)層(ceng)液(ye)中形成不(bu)同層(ceng)，這(zhe)樣可(ke)根據(ju)需要收(shou)獲目的(de)細(xi)胞。2實體組(zu)織材料(liao)的分(fen)離方法對於實體組(zu)織材料(liao)，由於細胞間(jian)結合緊(jin)密(mi)，為了(le)使(shi)組(zu)織中的細胞充分(fen)分(fen)散，形成細胞懸液(ye)，可(ke)采用機(ji)械(xie)分(fen)散法（物理(li)裂(lie)解）和消(xiao)化(hua)分(fen)離法。

三(san)、細胞增殖(zhi)檢(jian)測(ce)技(ji)術

目前主要有(you)兩(liang)種(zhong)用於(yu)檢測(ce)細(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)能力的方法。壹(yi)種(zhong)是直接的(de)方法，通過直接測(ce)定(ding)進(jin)行分(fen)裂

的(de)細胞數來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞的增殖(zhi)能力。另壹(yi)種(zhong)是間(jian)接的(de)方法，即細胞活力（cell viability）檢測(ce)方(fang)法，通過檢(jian)測(ce)樣(yang)品(pin)中健康(kang)細(xi)胞(bao)的數(shu)目來(lai)評(ping)價(jia)細(xi)胞的增殖(zhi)能力。顯然，細(xi)胞(bao)活力檢測(ce)法並不(bu)能最終證明(ming)檢測(ce)樣(yang)品(pin)中的細胞是(shi)否(fou)在(zai)增殖(zhi)。如細胞在(zai)某壹(yi)培(pei)養條(tiao)件(jian)下會(hui)自(zi)發(fa)啟(qi)動雕亡(wang)程(cheng)序(xu)，但藥(yao)物的(de)幹(gan)擾(rao)可(ke)抑(yi)制(zhi)雕亡(wang)的(de)發(fa)生(sheng)；這(zhe)時若采用細胞(bao)活力檢測(ce)法，顯然可(ke)以(yi)區分(fen)兩(liang)種(zhong)條(tiao)件(jian)下的(de)細(xi)胞(bao)數量，但我(wo)們(men)並(bing)不(bu)能從藥(yao)物幹(gan)擾(rao)組(zu)細胞(bao)數大(da)於對照組(zu)的事(shi)實說(shuo)明(ming)藥(yao)物可(ke)促(cu)進(jin)細胞(bao)增(zeng)殖(zhi)的結論(lun)。所(suo)以(yi)最直接的(de)證據(ju)應(ying)該采用方法壹(yi)。

取(qu)材(cai)：首(shou)先(xian)，用(yong)培(pei)養液(ye)濕潤(run)所(suo)取(qu)的(de)組(zu)織材料(liao)，並用鋒利的(de)眼科剪(jian)去除(chu)附在(zai)其(qi)上的脂肪和結締組(zu)織。接著用平衡(heng)液(ye)（如PBS或Hanks液(ye)）漂洗(xi)，再(zai)用(yong)眼(yan)科彎剪(jian)將組(zu)織塊(kuai)剪成小塊(kuai)。多次(ci)用(yong)PBS或Hanks液(ye)漂洗(xi)，直到液(ye)體清(qing)亮、無油(you)滴(di)為止(zhi)。

接(jie)種(zhong)：用濕(shi)潤的(de)吸管吸取(qu)切碎的(de)組(zu)織塊(kuai)，輕輕(qing)吹到培(pei)養瓶皿中，並按壹(yi)定間(jian)距(ju)均(jun)勻(yun)放(fang)在培(pei)養瓶底壁(bi)上。註(zhu)意(yi)不(bu)要過多，確(que)保(bao)組(zu)織塊(kuai)切面(mian)貼(tie)在培(pei)養瓶底壁(bi)上。

培(pei)養：將培(pei)養瓶翻轉(zhuan)，使(shi)瓶底朝上，在種(zhong)植了(le)組(zu)織塊(kuai)壹(yi)側的(de)對側面(mian)加(jia)足培(pei)養液(ye)，避免(mian)組(zu)織塊(kuai)與培(pei)養液(ye)接觸(chu)，然後(hou)塞(sai)緊(jin)瓶塞。將(jiang)種(zhong)植了(le)組(zu)織塊(kuai)的壹(yi)側朝上，靜(jing)置(zhi)於37℃培(pei)養箱(xiang)中。待組(zu)織塊(kuai)貼壁(bi)1到3小時後翻瓶，使(shi)貼壁(bi)的組(zu)織塊(kuai)浸(jin)沒(mei)在培(pei)養液(ye)中，繼續靜(jing)置(zhi)。換液(ye)：每隔(ge)2到3天更換壹(yi)次(ci)培(pei)養液(ye)，或者(zhe)根(gen)據(ju)培(pei)養瓶種(zhong)顏色的(de)變化確(que)定(ding)換液(ye)時間。

壹(yi)、原(yuan)代細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)

將(jiang)血(xue)球計(ji)數(shu)板(ban)及(ji)蓋片(pian)用擦(ca)試(shi)幹(gan)凈(jing)，並(bing)將(jiang)蓋片(pian)蓋在(zai)計(ji)數(shu)板(ban)上。

將(jiang)細胞懸液(ye)吸出(chu)少許(xu)，滴(di)加在(zai)蓋片(pian)邊緣(yuan)，使(shi)懸液(ye)充滿蓋片(pian)和計(ji)數(shu)板(ban)之(zhi)間。

靜(jing)置(zhi)3分(fen)鐘。

鏡下觀察，計(ji)算(suan)計(ji)數(shu)板(ban)四大(da)格細(xi)胞(bao)總數，壓(ya)線(xian)細胞只(zhi)計(ji)左(zuo)側(ce)和上方的。然後(hou)按下式(shi)計(ji)算(suan)：

細(xi)胞數/ml＝4大(da)格細(xi)胞(bao)總數/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡下偶(ou)見由(you)兩(liang)個以(yi)上細胞組(zu)成的細胞團，應(ying)按單(dan)個細(xi)胞計(ji)算(suan)，若細胞(bao)團占10%以(yi)上，說(shuo)明(ming)分(fen)散不(bu)好，需(xu)重新制(zhi)備(bei)細胞(bao)懸液(ye)。

二(er)、原(yuan)代細(xi)胞(bao)活力

將(jiang)細胞懸液(ye)以(yi)0.5ml加入(ru)試(shi)管中。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺(tai)盼蘭(lan)染(ran)液(ye)，染(ran)色2壹(yi)3分(fen)鐘。

吸取(qu)少(shao)許(xu)懸(xuan)液(ye)塗於載玻片上，加上蓋片(pian)。

鏡下取(qu)幾(ji)個(ge)任(ren)意(yi)視(shi)野分(fen)別計(ji)死(si)細(xi)胞(bao)和活細(xi)胞(bao)數，計(ji)細(xi)胞(bao)活力。

死(si)細胞能被(bei)臺(tai)盼蘭(lan)染(ran)上色，鏡下可(ke)見深蘭(lan)色的(de)細胞，活細(xi)胞(bao)不(bu)被(bei)染(ran)色，鏡下呈(cheng)無色透(tou)明(ming)狀。

活力測(ce)定(ding)可(ke)以(yi)和細胞計(ji)數(shu)合(he)起(qi)來進(jin)行，但要(yao)考(kao)慮到染(ran)液(ye)對原(yuan)細胞懸(xuan)液(ye)的加(jia)倍(bei)稀(xi)釋(shi)作用。